毕业论文（设计) （2013届本科）,短柄五加祛风湿酒的加工工艺初探 学院：生命科学与技术学院 专业：生物科学 班级：生物科学（2）班 作者姓名：苏金龙、张小惠、范建龙 指导老师：张博 职称：讲师 完成日期：2013年5 月20 日,陇东学院,短柄五加祛风湿酒加工工艺初探,苏金龙，张小慧 ,范建龙 （陇东学院生命科学与技术学院 ，甘肃 庆阳 745000） 摘要：本试验通过用不同浓度的乙醇为溶剂，在常温下对短柄五加茎皮内的物质进行提取，将提取液与黄酮类化合物的特征反应物质进行显色反应，证明了短柄五加茎皮含有黄酮类化合物。再用芦丁标品与提取物进行紫外、可见光谱分析，利用单因素试验及正交试验测定在不同提取方法下得到的黄酮类化合物的含量，进而得出其最佳浸提条件为：料液比1:10、乙醇浓度60%和浸提时间20天。依据以上条件，参考治疗风湿病运用较多的配方，以短柄五加茎皮、防风、香加皮、关白附、威灵仙、赤药、独活为原料，以纯粮食酒为提取液，泡制成具有宝石红色、酒药协调，但有苦、涩味特征的短柄五加茎皮祛风湿药酒。 关键词：短柄五加茎皮；祛风湿；黄酮类化合物；,引言：,短柄五加(Acanthopanax brachypus Harms.) 又名倒耙牛，为五加科五加属植物，始载于神农本草经，常作为中药五加皮而广泛使用1。在中药典籍中，其茎皮作为五加皮入药；本草纲目有云：“宁得一把五加，不用金玉满车”，足见其悠久的药用历史；在神农本草经、全国中草药汇编和中药志中将短柄五加、细柱五加、红毛五加、糙叶五加和轮叶五加的根皮或茎皮统称为“南五加皮”，主要用于治疗：风寒湿痹、筋骨痿软、小儿迟行、身体羸弱、水肿、脚气、皮肤湿疹、阴囊湿痒、神经衰弱等病。甘肃省中药材标准将短柄五加收载为地方标准，命名为甘肃刺五加（Rhizoma et Radix Acanthopanacis），也是属于濒危植物之一，其生于海拔1000-1500m的灌木林中或向阳山坡上，分布于我国陕西北部，宁夏六盘山和陇东至天水，临潭一带，子午岭林区2-3。,药用其干燥的根、根茎及茎，具有健脾益气，补肾安神，祛风湿，强筋骨的功能；主用于肾阳虚，体弱乏力，食欲不振，腰膝酸痛，失眠多梦，心悸健忘，头晕，头痛，筋骨痿软，四肢拘挛4。目前对其在根茎化学成分5-8、生殖生物学和生态学方面研究较多9，但其开发利用研究较少。 风湿病是一种侵犯关节、骨骼、肌肉、血管及有关软组织或结缔组织为主的疾病，多数为自身免疫性疾病，发病多较隐蔽缓慢，病程较长，且大多具有遗传倾向。在临床上，风湿给患者造成的主要危害在关节中，同样风湿性关节炎在发病期间也会对患者的关节形成极大的威胁，给人们的生活带来许多烦恼10。据中国中西医药结合学会风湿类疾病委员会抽样调查结果显示：在中国被抽样调查的106678人当中，风湿病患者达到18552人，占调查总数的17.4%。目前对于这类病的治疗，大多数的医学专家主张非手术治疗，即大多采用中药理疗的方法来治疗。,在主要通过药物治疗风湿病的现状下，本研究结合当地短柄五加资源丰富的特点、短柄五加茎皮的药理功能、参考用于治疗风湿病的现成配方，另辟蹊径，采用纯粮食酒作为提取液，进行摸索和探讨短柄五加祛风湿酒的加工工艺，为用短柄五加茎皮为主料治疗风湿病酒的研发提供一定的理论 基础。 1短柄五加研究状况 1.1短柄五加生物学特性 短柄五加为五加科五加属植物，分布范围极其狭窄，主要分布在我国西北黄土高原上的陕北、宁夏六盘山、甘肃陇东一带的灌木林中。叶有小叶3-5； 叶柄甚短，长仅2-4毫米；小叶片纸质，倒卵形至倒卵状长圆形，长3-6厘米，宽1-2.5厘米，先端圆形或短尖，基部狭尖，两面均无毛，边缘全缘，侧脉3-5对，上面不甚明显，下面隆起，明显，网脉在上面略下陷，下面不明显；无小叶柄或仅有长3毫米的小叶柄,伞形花序单生或2-4个组成顶生短圆锥花序，直径1-1.5厘米，有花多数；总花梗长1-2厘米，花后延长，无毛；苞片卵形，紫色，长约1毫米，先端丛生锈毛，边缘疏生纤毛；花梗长1-1.5厘米，无毛；花淡绿色；萼有短柔毛，边缘有5小齿；花瓣5，卵形，先端尖，长约2毫米，开花时反曲；雄蕊5，花丝长约2毫米；子房5室；花柱全部合生成柱状，长约0.8毫米。果实近球形，有5深棱，长约5毫米，宿存花柱长约2毫米。花期8月11。 1.2短柄五加的化学成分研究概况 目前对短柄五加的化学成分的研究并不是很多，据胡浩斌等对短柄五加化学成分的研究，已经证实的化学成分有香草醛、丹皮酚、香草酸、没食子酸甲酯、6,7,10-三羟基-8-十八烯酸、丁二酸、扁枝衣二酸、左旋贝壳杉-16-烯-19-酸、白桦脂酸、天麻苷、丁香苷，金丝桃苷，丁香苷，刺五加苷B1，右旋芝麻素，16-羟基-贝壳松-19-酸，左旋对映贝壳松烯酸，-谷甾醇，-谷甾醇葡萄糖苷，硬脂酸，棕榈酸，亚麻酸，维生素A、B1等12-13。,目前对短柄五加的化学成分的研究并不是很多，据胡浩斌等对短柄五加化学成分的研究，已经证实的化学成分有香草醛、丹皮酚、香草酸、没食子酸甲酯、6,7,10-三羟基-8-十八烯酸、丁二酸、扁枝衣二酸、左旋贝壳杉-16-烯-19-酸、白桦脂酸、天麻苷、丁香苷，金丝桃苷，丁香苷，刺五加苷B1，右旋芝麻素，16-羟基-贝壳松-19-酸，左旋对映贝壳松烯酸，-谷甾醇，-谷甾醇葡萄糖苷，硬脂酸，棕榈酸，亚麻酸，维生素A、B1等12-13。 1.3短柄五加的药理作用研究概况 短柄五加是我国特有的民间药用植物，其药用部位主要是茎皮和根，具有益气健脾、养心安神、活血化瘀、通窍经络作用。据研究表明五加茎皮有祛风湿、活血去瘀、治风寒湿痹、壮筋骨、筋骨挛急抗炎、镇痛、镇静、腰痛、阳痿、脚弱、小儿行迟、水肿、脚气、疮疽肿毒作用，能提高血清抗体的浓度、促进单核巨噬细胞的吞噬功能，有抗应激作用，能促进核酸的合成、降低血糖，有性激素样作用，并能抗肿瘤、抗诱变、抗溃疡，且有一定的抗排异作用14-16。,2材料与方法 2.1仪器 、药品和材料 2.1.1仪器 PC-1000数显式电热恒温水浴锅，上海跃进医疗器械厂；UV757CRT紫外可见分光光度计，棱光仪器公司；电子天平ISO9001,北京赛多利斯科学仪器有限公司；SHB-3型循环水多用真空泵，郑州杜甫仪器厂；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发器，巩义市予华仪器有限责任公司； DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；冰箱BCD-220MLVP,苏州三星电子。 2.1.2药品 芦丁:上海生化试剂二厂,乙醇、石油醚、乙醚、硼氢化钠、水杨酸、H202、FeSO4、AlCl3、NaOH、HCL、FeCl3、镁粉、NaNO2、A1(NO3)3，以上化学药品均为分析纯。 2.1.3实验材料 采自甘肃省正宁县中湾林场段子午岭林区的短柄五加。,2.2短柄五加茎皮有效成分提取方法 精确称取2.00g短柄五加茎皮粉末，利用单因素分析法，分别研究料液比、提取时间和提取液浓度对短柄五加茎皮的有效成分提取效果的影响。采用正交试验法得出短柄五加祛风湿酒的最佳提取工艺。 2.3提取液中黄酮类化合物的定性分析 2.3.1提取物的颜色反应 取一定量短柄五加茎皮提取液，减压浓缩，再用石油醚脱脂，烘干得黄酮类粗品，分别与硼氢化钠、A1Cl3、Mg粉+HCL、NaOH反应。 2.3.2 吸收光谱分析 取短柄五加茎皮提取液4ml、芦丁标准品10mg分别加入70的乙醇定容至100ml、各取一定体积测其紫外、可见光谱。取上述经过稀释的提取液及芦丁标品各20ml，加1.2ml5NaN02，摇匀，静置6min，再加10Al(NO3)3 1.2ml，摇匀，静置6min，再加入4NaOH 8ml，加水0.8ml，摇匀，静置15min，以70的乙醇为空白对照。在210410nm范围内,间隔2Onm测其紫外光谱和在410810nm范围内间隔100nm测其可见光谱。 2.3.3 短柄五加茎皮提取液黄酮含量的测定 吸取芦丁标准液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.O ml分别加70%乙醇定容至20ml，按2.3.2测铝盐光谱的操作进行，选择2.3.2所测得的芦丁铝盐可见光区吸光度最大时的波长作为入射波长测吸光度，用最小二乘法得工作曲线。同样操作，测短柄五加茎皮黄酮类化合物提取液的吸光度，代入工作曲线求黄酮类化合物浓度，然后代入公式m=VV2CV1计算，即可计算出短柄五加茎皮黄酮类化合物提取量。式中，V为短柄五加茎皮乙醇提取液总体积；V1为从总黄酮提取液中取出测吸光度的黄酮液体积；V2为V1经稀释后的体积；C为回归方程算出的黄酮类化合物浓度；m为提取的短柄五加茎皮的质量。 2.4短柄五加茎皮祛风湿药酒的制作方案 2.4.1 短柄五加祛风湿酒的配方 短柄五加茎皮250g 防风250g 香加皮125g 关白附100g 威灵仙250g 赤芍150g 独活125g,2.4.2 配方中各材料的药理作用17,2.4.3 短柄五加祛风湿酒的加工流程18,短柄五加茎皮,分选,清洗,剥皮,自然风干,称量、加入配料,第一次浸提,粗滤,滤渣,第二次浸提,粗滤,滤渣,第三次浸提,粗滤,滤渣,粗 滤 液,过滤,装瓶,包装,短柄五加茎皮祛风湿酒,3 结果与分析 3.1 短柄五加茎皮提取液中的黄酮类化合物的定性分析 取短柄五加茎皮乙醇提取的浓缩液分别加入以下试剂后，结果见表1。 表 1 短柄五加茎皮乙醇提取物的颜色反应 综合短柄五加茎皮提取液的颜色反应结果，说明茎皮提取液中含有黄酮类化合物，这些黄酮类化合物中可能包含有黄酮醇及双氢黄酮19-20。,3.2 吸收光谱 按2.3.2操作，测出芦丁标品、短柄五加茎皮黄酮类化合物及其鋁盐络合物的紫外、可见吸收光谱，见图1-4。 图 1 芦丁、短柄五加茎皮黄酮类化合物的紫外光谱 图 2 芦丁、短柄五加茎皮黄酮铝盐的紫外光谱,图 3 芦丁、短柄五加茎皮黄酮类化合物可见光谱 。 图 4 芦丁、短柄五加茎皮黄酮铝盐可见光谱 通过对比芦丁标准液及短柄五加茎皮提取物的上述光谱曲线图，可见它们非常相似，二者在280nm、380nm及5lOnm处均有较高吸收峰，表明短柄五加茎皮提取液中含有黄酮类化合物。,3.3 标准曲线及提取液中黄酮类化合物含量的测定 根据上述色谱分析，选择5lOnm波长作为测试波长，用比色法测得工作曲线及回归方程（图5）。,浓度（mg/ml）,OD值（A510nm）,图 5 芦丁标准曲线,取短柄五加茎皮提取液2m1，用70的乙醇定容至20ml，然后按照制作工作曲线同样的操作，在波长51Onm处测吸光度，代入工作曲线及公式即可计算出黄酮类化合物的提取量。,3.4 提取条件的选择 3.4.1 不同浓度的乙醇提取剂对黄酮化合物提取量的影响 表 2 不同浓度的乙醇对短柄五加茎皮中黄酮类化合物的提取效果影响 由表2可知，不同浓度的乙醇提取剂对短柄五加茎皮黄酮类化合物的提取效果不同，用35%的乙醇提取效果最差, 60%的乙醇提取效果最好,故在短柄五加祛风湿酒的泡制中选择60的纯粮食酒作为酒基比较理想。粮食酒的浓度越高，提取效果可能会越好，但是会直接影响药酒的口感，而且市面中也很难找到这样的高浓度粮食酒。,