白细胞介素12的抗肿瘤机理研究,内容提要,白介素12的抗肿瘤效果 白介素12的抗肿瘤机理 白介素12可能的临床应用 白介素12的历史 白介素12在国外的现状 白介素12申报国内肿瘤治疗的可行性,白介素12的抗肿瘤效果,Interleukin 12 (IL-12) 白介素12,由抗原呈递细胞在受到外源物质（包括内毒素）刺激时分泌 属于“危险信号”之一：和外源侵入相关 修饰T细胞或者NK细胞，决定后天免疫走向 先天免疫与后天获得性免疫之间的衔接因子 刺激靶细胞g-干扰素分泌（Th1型免疫应答） 至今发现的最有效的抗肿瘤单因子 作用与范围与内毒素十分相似 单独用药可以治愈小肿瘤（90%) 2) 肿瘤体积减小（少见) 3) 治愈 （罕见),治疗,0-30 天,肿瘤细胞,如何做肿瘤治疗效果试验,白介素单独使用的最佳治疗效果实例,白介素单独治疗一般只对某些初期建立的小肿瘤（3周）的大肿瘤负担（15毫米直径，%体重）一般无法治愈 白介素配合化疗在某些肿瘤模型有出奇的疗效,白介素12 结合化疗治疗 32天小鼠MCA207肿瘤模型：治疗前,环磷酰胺加白介素12（Cy+IL-12)治疗一周,环磷酰胺加白介素12治疗2周,环磷酰胺加白介素12治疗3周,环磷酰胺加白介素12治疗4周,环磷酰胺加白介素12治疗5周,环磷酰胺加白介素12治疗6周,通过白介素12提高化疗的抗肿瘤效果,no Rx,Cy alone,IL-12 alone,Cy+IL-12,18天腹腔实体MCA207肿瘤,14天静脉注射建立的肺扩散肿瘤模型,Cy+IL-12在腹腔及肺扩散肿瘤模型中的治疗效果,接瘤途径,治疗（起始天数）,治愈率（存活天）,i.p.腹腔,i.p.腹腔,i.v.肺扩散,对照,Cy+IL-12 (18),Cy+IL-12 (14),0/5 (20-27),0/5 (21-31),5/5 (90),8/8 (90),i.v.肺扩散,对照,IL-12和Cy+IL-12在Sa1腹水肿瘤模型中的治疗效果,100%,50%,0%,对照,IL-12,Cy,Cy+IL-12,0,10,20,30,40,接种,治疗,存活率,天数,白介素12的抗肿瘤机理研究,Cy+IL-12的抗肿瘤作用是Th1型T免疫应答,宿主,治愈率,正常,T细胞受体敲除鼠 （T细胞缺失）,裸鼠 （T和B细胞缺失）,咖玛干扰素敲除鼠 （Th 1型缺失）,白介素-4敲除鼠 （Th 2型缺失）,10/10,0/5,0/20,0/20,10/10,与肿瘤排斥所对应的强免疫反应,CD4,CD8,治疗之前,治疗之后,白介素12启动的抗肿瘤免疫细胞分布,例子1,例子2,T细胞,巨嗜细胞,巨噬细胞可能是靶效应细胞的证据,T 细胞染色,TUNEL自杀细胞染色,H&E组织学染色,巨嗜细胞染色,白介素12启动的抗肿瘤免疫应答对肿瘤增生的抑制,对照,治疗,溴嘧啶标记肿瘤增生,环磷酰胺加白介素是否对所有肿瘤有效？,有效肿瘤模型:C57B/6: MC203, MCA205, MCA207, FBL-3BALB/c: CT26, CSA1M, OV-HMA/J: Sa1 无效肿瘤模型:C57BL/6: MCA101,B16, LLC, Pan02, EL-4C57BL/6: autochthonous primary tumorsBALB/c: 4T1, S180,为什么白介素12在有的肿瘤治疗模型里如此有效，但在其他肿瘤治疗模型几乎无效？,对白介素12有无应答的肿瘤模型对比,免疫型肿瘤 与 共存(预存)免疫的概念,免疫型肿瘤就是能够在接种后不久自动诱发宿主免疫识别的肿瘤 识别的结果肿瘤生长与抗肿瘤免疫共存,什么是共存（预存）免疫？,肿瘤与抗肿瘤免疫之间的平衡 宿主免疫系统对肿瘤抗原有特异性识别 肿瘤通过提供抗原维持这个免疫应答 这个免疫应答对肿瘤有遏制作用 应答的性质属于Th1型细胞应答,预存免疫的状态决定IL-12或Cy+IL-12疗效,免疫细胞转导试验步骤,正常供体小鼠,肿瘤疫苗,肿瘤接种,排斥接种,T细胞缺失受体小鼠,肿瘤接种,14 day,输入T细胞,T cell,IL-12/Cy+IL-12 治疗,治疗效果?,2 day,预存免疫在白介素12治疗中的关键作用,输入细胞,治疗,治愈率,无,未分化T细胞,肿瘤特异T细胞,IL-12,生理盐水,IL-12,IL-12,Cy+IL-12,0/10,0/8,0/8,1/10,9/12,10/10,Cy+IL-12,0/5,未分化T细胞,未分化T细胞,肿瘤特异T细胞,肿瘤特异T细胞,生理盐水,受体：带MCA207肿瘤14天的T细胞缺失小鼠,荷瘤鼠作为T细胞供体（预存免疫）的试验,供体细胞,治疗手段,治愈率,生理盐水,IL-12,IL-12,Cy+IL-12,Cy+IL-12,0/5,0/5,3/5,0/5,5/5,5/5,荷瘤0天脾脏T cell,Cy+IL-12,0/5,受体：带MCA207肿瘤14天的T细胞缺失小鼠,荷瘤10天脾脏T cell,荷瘤10天脾脏T cell,荷瘤10天脾脏T cell,荷瘤28天脾脏T cell,荷瘤28天脾脏T cell,荷瘤28天脾脏T cell,生理盐水,预存免疫是决定荷瘤鼠对白介素12治疗应答与否的关键条件 为什么？,白介素12受体表达特征,未分化T细胞不表达白介素12 受体（不受影响） 激活的T细胞表达白介素12受体 表达为激活后的37天内，以后不再表达,环磷酰胺加白介素12疗效解释上的一个困惑 如果对白介素12应答好坏由受体表达决定， 那化疗是如何提高白介素12受体表达的？,传统的解释,肿瘤晚期免疫受到抑制 抑制性T细胞（Treg）生成 T细胞不表达白介素12受体 对白介素12单独治疗不应答 化疗药杀死Treg 抑制性T细胞由于代谢较高，对化疗药敏感 去除抑制性T细胞之后释放了被抑制的抗肿瘤应答 抗肿瘤T细胞被激活，表达白介素12 受体,去除免疫抑制在我们的肿瘤模型中不起关键作用 其他解释？ 化疗对肿瘤的杀伤导致抗原释放激活预存免疫,化疗激活抗肿瘤免疫？ 我们做的是化疗还是免疫治疗？,预存免疫的状态决定化疗疗效 免疫参与对化疗疗效的贡献 化疗的疗效在没有免疫功能的情况下会不同吗？ 无法在人体内进行对比 但可以在试验小鼠体内进行对比,T细胞对肿瘤发展与化疗疗效的影响,治疗开始后天数,肿瘤大小,正常鼠+环磷酰胺,T细胞敲除鼠+环磷酰胺,正常鼠+对照,T细胞敲除鼠+对照,阿霉素与建择在正常与T细胞缺失鼠中的疗效对比,治疗开始后天数,肿瘤大小,正常鼠+阿霉素,T细胞敲除鼠+阿霉素,正常鼠+建择,T细胞敲除鼠+建择,相似的疗效差异用T细胞清除抗体也能看到,治疗开始后天数,肿瘤大小,环磷酰胺,环磷酰胺+ 抗CD4/CD8,阿霉素,阿霉素+抗CD4/CD8,抗CD4/CD8,大肿瘤模型中T细胞对化疗疗效的贡献,治疗开始后天数,肿瘤大小,正常鼠+环磷酰胺,T细胞敲除鼠+环磷酰胺,化疗是如何激活抗肿瘤免疫的呢？,药物对肿瘤细胞的直接杀伤是必要条件 排除去抑制解释：杀死抑制性T细胞（Treg） 直接杀伤导致抗原短期集中释放 释放的肿瘤抗原不足以启动全新的抗肿瘤应答，但可以激活预存的抗肿瘤应答,其他化疗药与白介素12的联合使用疗效,化疗+IL-12,治愈率（%）,阿霉素（全身）,80100,环磷酰胺,阿霉素（瘤内，脂质体）,0,60100,建择（全身）,020,建择（瘤内，自由体）,2040,5氟,0,长春碱,0,肿瘤模型：24周MCA207皮下肿瘤， 1017毫米直径 治疗：化疗单次给药，3天后开始白介素12（隔天一次x3次） 化疗或者白介素12单独对照0%治愈率,药物必须对肿瘤细胞有足够的直接杀伤,药物及剂量,对体细胞及肿瘤的杀伤,疗效 （与对照比较）,环磷酰胺25mg/kg,10%,无,环磷酰胺50mg/kg,30%,弱,环磷酰胺75mg/kg,50%,强,环磷酰胺125mg/kg,70%,强,阿霉素10mg/kg 全身,70%,90%,100%,100%,100%,白细胞,10%,50%,70%,50%,?,阿霉素5mg/kg瘤内,50%,10%,?,显,建择150mg/kg全身,30%,?,无,建择50mg/kg瘤内,30%,30%,?,显,模型：1014天MCA207皮下肿瘤,宿主必须具备预存免疫,免疫型（immunogenic)与非免疫性（non-immunogenic）肿瘤的差别 免疫型：能在宿主中诱发免疫识别的肿瘤 非免疫性：不能诱发免疫识别的肿瘤 免疫型与非免疫型是个相对概念 加强预存免疫可以提高疗效 预存免疫是另一个保障化疗疗效的必要条件 肿瘤疫苗的作用,提高预存免疫可以增强化疗疗效,单独化疗不足以治愈大肿瘤负担 提高预存免疫可以通过转入抗肿瘤细胞实现 单纯转入抗肿瘤细胞无法看到明显抗肿瘤效果 如果在提高预存免疫之后开始化疗呢？,提高预存免疫可以增强化疗疗效的实例 （先过继抗肿瘤免疫细胞后再化疗的试验）,化疗开始后天数,肿瘤大小,-2天过继未分化脾细胞+Cy,-2天过继抗肿瘤脾细胞+Cy,）14天的MCA207肿瘤模型；）细胞转导后第三天化疗,无治疗对照,过继抗肿瘤脾细胞,过继预存免疫需要在化疗前或者3天之内而不是化疗有效后（7天）实施才会有效,化疗开始后天数,肿瘤大小,Cy 3天+过继抗肿瘤脾细胞,Cy 7天+过继抗肿瘤脾细胞,Cy,过继的抗肿瘤免疫细胞是否被化疗释放的肿瘤抗原激活？,单独化疗有效期,抗肿瘤T细胞过继,无效,抗原集中释放期,有效,0,14,-2,7,化疗后伴随的肿瘤坏死,MCA207肿瘤对照,环磷酰胺3天后,化疗后局部注射树突细胞可以提高疗效,化疗开始后天数,肿瘤大小,对照,Cy,Cy+ DC (2天),Cy+ DC (6天),过继的抗肿瘤免疫细胞是否被化疗释放的肿瘤抗原激活？,单独化疗有效期,抗肿瘤T细胞过继,有效,抗原集中释放期,0,14,-2,7,局部树突细胞注射,无效,化疗激活抗肿瘤免疫的直接证据,体内测试：Winn氏法检验脾细胞抗肿瘤活性 体外测试：肿瘤抗原刺激下的T细胞干扰素释放 瘤内检验：化疗前后T细胞浸润对比,Winn氏法检验脾细胞抗肿瘤活性,肿瘤与脾（免疫）细胞混合后接种 无抗肿瘤能力的脾细胞能促进成瘤（feeder） 有抗肿瘤能力的脾细胞能抑制成瘤 抗肿瘤能力是否特异可以用不相关肿瘤做对照 特异性表明是T细胞应答 通过观察成瘤的时间和成（抑）瘤率可以测试脾细胞中是否含有特异抗肿瘤免疫细胞 肿瘤免疫的金标准,化疗前后宿主体内抗肿瘤免疫能力的对比,抑瘤率,接瘤后时间（天）,对照,化疗后10天,化疗后7天,化疗后3天,对照： 1）未分化脾细胞+207肿瘤2）207免疫脾细胞+203肿瘤,化疗前后宿主脾细胞对肿瘤抗原的体外应答,细胞免疫（Th 1型）应答是抗肿瘤的最佳应答 抗肿瘤特异的T细胞受到抗原刺激时分泌干扰素 脾细胞与加了肿瘤抗原的树突细胞共培养 测试伽玛干扰素的分泌 伽玛干扰素水平可以表明抗肿瘤应答的活性 优于传统的CTL法（很少有假阳性）,化疗前后宿主脾细胞对肿瘤抗原的体外应答,伽玛干扰素分泌,未分化化疗前Cy 阿霉素长春碱,7天后,化疗前后瘤内免疫细胞浸润的变化,化疗前,化疗后10天,每组5个肿瘤的切片,化疗直接杀伤,抗原释放,激活预存免疫（记忆应答）,攻击肿瘤,疗效？,肿瘤死亡,化疗的免疫学解释,化疗的最终疗效是直接杀伤和免疫攻击的总和 病人对化疗应答的巨大个体差异有可能来自： 1）治疗时抗肿瘤预存免疫的水平 2）药物是否可以杀死肿瘤 3）死亡的肿瘤是否可以释放可识别抗原 4）激活的抗肿瘤免疫是否可以持续,