日粮中添加不同水平 的NDOs对锦江黄牛 瘤胃微生物生长、 发酵及组成的影响,报告人：戈婷婷指导老师：瞿明仁 教授,开题报告,目录,研究背景及进展研究意义研究内容及方法技术路线研究预期结果试验创新点,一、研究背景,随着人们生活水平的提高，对牛肉的需求量增加 近年来畜产品安全事件不断发生（如“三聚氰氨”） 在肉牛饲料中大量使用抗生素、激素，使牛肉及其产品存在安全隐患 因此，开发研制绿色、安全、环保、高效的营养生理调节剂，已成为学术研究的热点，也成为畜牧业可持续发展的当务之急,一、研究背景,非消化性寡糖（non-digestible oligosaccharides, NDOs）是指不能被动物体分泌的消化酶所消化或在动物消化道流通过程中未被消化的低聚糖,一般由2-10个单糖分子构成NDOs是一种具有多种功能的营养生理活性物质,1.促进有益菌的增殖 2.提高机体的免疫机能 3.调控动物消化道内的微生物区系 4.促进营养物质的消化吸收 5. 预防机体的氧化损伤 6.提高动物的生产性能,营养生理活性物质的作用,二、研究进展,研究进展,Gamo等的体外实验表明，GOS可以降低反刍动物的甲烷产量,1995,瞿明仁，凌宝明等.研究表明1.0%果寡糖对生长绵羊瘤胃发酵功能作用效果最优,2002,2007,2005,刘兵，瞿明仁等.研究 发现日粮中添加1.2%的SBOS更有利于绵羊瘤胃发酵的调控,J.D.Quigley等研究发现饲喂添加FOS的血清代乳料，可降低犊牛的腹泻，减少抗生素和电解质的使用，提高犊牛的体增重和饲料转化率,2000,Newman等报道在牛代乳料 中添加MOS，可提犊牛的 日增重，并降低疾病发生率,三、研究意义,NDOs对锦江黄牛瘤胃的功能作用，从而提高牛 肉产品的品质，这在畜牧业生产中具有重要意义目前有关非消化寡糖在反刍动物的研究报道较 少，所以本研究对推动NDOs在反刍动物中的应用具有重要意义研究报道出现不一的现象（掩盖效应和稀释效 应），所以本试验采用体内和体外、传统和现代相结合的方法，在方法上具有一定的创新意义,四、研究内容,研究内容,（1）锦江黄牛NDOs适宜品种及添加水平的初步筛选 （2）不同水平NDOs对锦江黄牛瘤胃微生物DMNP、MOEF及模型的影响 （3）不同水平NDOs对锦江黄牛瘤胃微生物DGGE图谱带数(Ni)、 总带数（N）及丰度（P）影响 （4）不同水平NDOs对锦江黄牛瘤胃微生物总数、组成及比例 的影响 （5）不同水平NDOs对锦江黄牛瘤胃发酵参数、发酵特征及内容物酶活的影响,五、试验设计,体外实验 （批次培养法）,体内实验 （饲养试验）,总结、分析、得出 锦江黄牛NDOs适宜 的添加品种及水平,发酵参数,微生物N产生 量DMNP,微生物生长效 率MOEF,对微生物总数 及比例的影响 （传统方法）,对发酵参数及 酶活的影响,对微生物DGGE 图谱带数（Ni）、 总带数（N）及 丰度（P）影响 （16SrDNA和 DGGE技术）,不同品种和水平 的NDOs,六、试验方法（体外试验）,高水平组,中水平组,低水平组,对照组,5头安装 瘤胃瘘管 的锦江黄牛 采集瘤胃液,NDOs作为 处理因素,水浴摇床 体外培养 24小时,用于测定pH、 VFA、MCP、 NH3-N、NDF、 DMNP、MOEF,六、试验方法,筛选出NDOs 的添加品种 及水平,0.4%,0.8%,1.2%,1.6%,2.0%,2.0%,1.6%,1.2%,0.8%,0.4%,0%,0%,果寡糖,甘露寡糖,体外培养,测定指标,VFA BCP NH3-N,VFA: 用日本岛津GC一7A气相色谱仪以内标法进行测定 BCP: 采用差速离心法分离，再按凯氏微量定氮法常规测定 NH3-N: 参照冯宗慈等(1993)方法,测定指标,NDF pH DMNP MOEF,NDF:参照杨胜主编的饲料分析与饲料质量检测技术(1993) pH: 用pH计测得 DMNP、MOEF:参照孟庆翔（1998）“瘤胃稀释率对蛋白质发酵和微生物生长效率的影响”中的测定方法,六、试验方法（体内试验）,5头安装 瘤胃瘘管 的锦江黄牛 随机分3组,青干草+精料预混料+低水平NDOs,青干草+精料预混料+中水平NDOs,青干草+精料预混料+高水平NDOs,于第3天采集 瘤胃液样本,预饲期10天 正式期5天,试验设自身对照,测定指标,1）采用直接法提取瘤胃微生物总DNA 2）采用 DNA凝胶 回收试剂盒对DNA进行纯化 3）瘤胃细菌16S rDNA全序列PCR扩增 ：引物8f：5 CAC GGA TCC AGA GTT TGA T(C/T)(A/C)TGG CTC AG1510r：5 GTG AAG CTT AGG G (C/T)T ACC TTG TTACGA CTT 4）PCR产物DGGE图谱的分析：应用BioRad DCode Universal Mutation System DGGE电泳系统 5）根据DGGE图谱信息得出样品DGGE指纹图谱带数(Ni) 、总带数(N)及丰度系数(P=Ni/N),DGGE图谱 带数(Ni) 总带数(N) 及丰度(P),测定指标,细菌和纤维菌总数：采用Hungate滚管法 甲烷菌的计数：采用最大可能计数法。用青霉素培养2周后用气相色谱仪测定甲烷气，然后换算得出甲烷菌数 原虫的计数：样品经MFS染色后，充满计数板，然后在光学显微镜下镜鉴。纤毛虫数/ml=ND1000（N：所有方格中纤毛虫数；D：稀释倍数）,细菌、纤维菌、 甲烷菌及原虫,测定指标,纤维素酶 木聚糖酶 蛋白水解酶 总脱氢酶,蛋白水解酶：按哈兹耶夫方法测定。每分钟催化酪蛋白水解生成lg酪氨酸的酶量定义为一个酶活单位 纤维素酶：按Steward方法测定，以纯棉花在瘤胃液中培养48 小时(38)的消失率代表瘤胃液中纤维素酶的相对活力 总脱氢酶：按哈兹耶夫方法测定。以38.5,pH6.8条件下，每分钟引起测定液吸光度上升0.1的酶量定义为1个酶活单位 木聚糖酶：按费笛波方法测定 。1g固体酶粉在温度为40，pH值5.0条件，1min水解木聚糖生成相当于1mol木糖还原物质的量为1个酶活力单位,七、试验预期成果,1）对锦江黄牛瘤胃微生物的区系结构、多样性影响规律 2）对锦江黄牛瘤胃发酵类型、发酵参数、发酵活力影响规律 3）对锦江黄牛瘤胃液中纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、总脱氢酶蛋白酶等主要酶活性的影响规律及特征 4）对锦江黄牛瘤胃微生物总量、生长速率、生长模型影响规律 5）得出锦江黄牛NDOs的适宜添加品种及水平,八、试验创新点,1）在研究内容上，目前尚未见日粮中添加不同水平及组合NDOs对锦江黄牛瘤胃微生态系统结构与功能影响的研究报道 2）在研究思路上，本研究将根据微生态学和广义营养学观点，研究非消化性寡糖在反刍动物的作用、机理及应用效果，这对推动NDOs在反刍动物中的应用具有非常重要的意义,八、试验创新点,3）在研究方法上，采用体内与体外、现代与传统相结合的方法，运用先进的“16S rDNA”技术和DGGE技术及传统培养技术，避免用单一的传统方法或现代分子生物学方法得出片面的研究结果，从而提高了研究的可靠性,Thank you！,