凝胶渗透色谱法,GPC,贾庆岩 2013-5-3,体积排阻色谱法定义及分类体积排阻色谱法(SEC)：利用多孔凝胶固定相的独特特性而产生的一种主要依据分子尺寸大小进行分离的方法。,凝胶渗透色谱 (GPC: Gel permeation chromatography) 主要用于聚合物领域 以有机溶剂为流动相(氯仿，THF，DMF) 常用固定相填料：苯乙烯二乙烯基苯共聚物 凝胶过滤色谱 (GFC: Gel filtration chromatography),主要用于生命科学领域 以水溶液为流动相 常用固定相填料：亲水性有机凝胶(葡聚糖， 琼脂糖，聚丙烯酰胺等),一、绪论,1964年由J. C. Moore首先研究成功(J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 1964, 2(2): 835-843)以苯乙烯和二乙烯基苯在不同的稀释剂存在下制成了一系列孔径不同的凝胶，可以在有机溶剂中分离分子量从几千到几百万的试样；第二年Maly用示差折光仪为浓度检测器，以体积指示器为分子量检测器制成凝胶色谱仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。,凝胶渗透色谱法(GPC)是一种新型的液相色谱。,主要特点：操作简便快捷、进样量小；数据可靠且重现性好、自动化程度高等。 应用领域：聚合物分子量及其分布聚合物的支化度的测定聚合物分级及其结构分析高聚物中微量添加剂的分析测定高聚物的绝对分子量,二、基本原理,凝胶渗透色谱是一种液相色谱，原理是利用高分子溶液通过一根装填有凝胶的柱子，在柱中按分子大小进行分离。柱子为玻璃柱或金属柱，内填装有交联度很高的球形凝胶。其中的凝胶类型有很多，都是根据具体的要求而确定(常用的有聚苯乙烯凝胶)。然而无论哪一种填料，他们都有一个共同点，就是球形凝胶本身都有很多按一定分布的大小不同的孔洞。,当被分析的试样随着淋洗溶剂进入柱子后，溶质分子即向填料内部孔洞扩散。较小的分子除了能进入大的孔外，还能进入较小的孔；较大分子则只能进入较大的孔；而比最大的孔还要大的分子就只能留在填料颗粒之间的空隙中。随着溶剂的淋洗，大小不同的分子就得到分离，较大的分子先被淋洗出来，较小的分子较晚被淋洗出来。,溶质分子的体积越小，其淋出体积越大。这种解释不考虑溶质与载体之间的吸附效应以及在流动相和固定相之间的分配效应。淋出体积仅仅由溶质分子尺寸和载体的孔尺寸决定，分离完全是由于体积排除效应所致，故称为体积排除机理。,GPC柱,MW与V之间的关系,GPC理想校正曲线,由凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是把凝胶色谱曲线中的淋洗体积V转化成分子量M，这种分子量的对数值与淋洗体积之间的关系曲线（Log M-V）称之为分子量校正曲线,分子量校正曲线(Log M-V曲线),排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。随固定相不同，排阻极限范围约在400至60106之间。渗透极限能够完全进入凝胶颗粒孔穴内部的最大分子的分子量。在选择固定相时，应使欲分离样品粒子的相对分子质量落在固定相的渗透极限和排阻极限之间。,Hi： 峰高 Mi：分子量,应用GPC峰高法计算平均分子量,需要GPC软件才可计算Mw,GPC仪的组成：泵系统、（自动）进样系统、凝胶色谱柱、检测系统和数据采集与处理系统。,三、GPC仪器配置,Waters 1515型凝胶渗透色谱仪,泵系统：包括一个溶剂储存器、一套脱气装置和一个高压泵。它的工作是使流动相（溶剂）以恒定的流速流入色谱柱。泵的工作状况好坏直接影响着最终数据的准确性。越是精密的仪器，要求泵的工作状态越稳定。要求流量的误差应该低于0.01mL/min。,色谱柱：,按照样品所溶解的溶剂来选择柱子所属系列 THF、氯仿、DMF。 必须选择合适的溶剂来溶解聚合物。按照样品分子量范围来选择柱子型号 样品分子量应处在排阻极限和渗透极限范围内，并且最好是处在校正曲线线性范围内。,载体是GPC产生分离作用的关键。,GPC 仪器对载体的要求： 1. 良好的化学稳定性和热稳定性； 2. 有一定的机械强度； 3. 不易变形; 4. 流动阻力小； 5. 对试样没有吸附作用； 6. 分离范围越大越好（取决于孔径分布)等； 7. 载体的粒度愈小，愈均匀，堆积的愈紧密，色谱柱分离效率愈高。,GPC载体的种类： 1. 交联聚苯乙烯凝胶； 2. 多孔性玻璃； 3. 半硬质及软质填料包括聚乙酸乙烯酯凝胶及聚丙烯酰胺凝胶； 4. 木质素凝胶等。,检测系统： 通用型检测器：适用于所有高聚物和有机化合物的检测。有示 差折光仪检测器、紫外吸收检测器、粘度检测器。示差折光仪检测器：溶剂的折光指数与被测样品的折光指数有尽可能大的区别。紫外吸收检测器：在溶质的特征吸波长附近溶剂没有强烈的吸收。选择型检测器：适用于对该检测器有特殊响应的高聚物和有机化合物。有紫外、红外、荧光、电导检测器等。,直接法：把激光光散射与凝胶色谱仪联用，在得到浓度谱图的同时，还可得到散射光强对淋出体积的谱图，从而计算出分子量分布曲线和整个试样的各种平均分子量。把GPC仪与光散射仪连用，由光散射仪连续测定聚合物样品中各个级分的相对分子质量，由GPC仪中的浓度示差检测器检测各个级分的浓度，就可以得到聚合物的各种平均相对分子质量。,四、实验部分,间接法：用已知相对分子质量的单分散标准聚合物预先做一条淋洗体积或淋洗时间和相对分子质量对应关系曲线，该线称为“校正曲线”。在相同的测试条件下，做一系列的GPC标准谱图，对应不同相对分子质量样品的保留时间，以 lg M 对 t 作图，所得曲线即为“校正曲线”。通过校正曲线，就能从GPC谱图上计算各种所需相对分子质量与相对分子质量分布的信息。,间接法分析大致步骤:,(1) 根据样品的特点选择合适的GPC柱子和标样，并且确定采用的GPC校正方法; (2) 配制标样和样品，用进样器进样得到色谱图; (3) 用数据采集器和GPC软件生成校正曲线并计算样品平均分子量，制作报告。,常见的标样：聚苯乙烯(PS，溶于各种有机溶剂) 聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA) 聚环氧乙烷 (PEO，也叫聚氧化乙烯，溶于水) 聚乙二醇(PEG，溶于水),注意事项：由于凝胶色谱中浓度检测通常使用示差折光检测器，其灵敏度不太高，所以试样的浓度不能配置得太稀。但另一方面色谱柱的负荷量是有限的，浓度太大易发生“超载”现象。一般情况下，进样浓度按分子质量大小的不同在0.050.5%(质量分数)范围内配置。分子质量越大，溶液浓度越低。标样配制应该严格按照标样说明书进行。通常室温静置12小时以上，然后轻轻混匀。绝对不能超声或者剧烈振荡来加速溶解。溶液进样前应先经过过滤，以防止固体颗粒进入色谱柱内，引起柱内堵塞，损坏色谱柱。,进样浓度范围及体积：,分子量范围 样品浓度：低于5,000 1.0% 5,00025,000 0.5% 25,000200,000 0.25% 200,0002,000,000 0.1% 高于2,000,000 0.05% 进样体积：50-100uL之间(浓度在0.05%-0.5%之间),校正曲线,逐一注入聚合物标样以确定分子量与保留时间的关系,常用线性拟合或者三次方拟合,GPC校正方法,窄分布标样校正法选用与被测样品同类型的单分散性(d1.1)标样，先用其他方法精确测定其平均相对分子质量，然后与被测样品在同样的条件下进行GPC分析。 普适校正法此法的优点是只要用一种高聚物（一般用窄分布聚苯乙烯）作标准曲线就可以测定其他类型的聚合物，但先决条件是2种高聚物的K和值必须己知。渐进试差法(宽分布标样校正法)这种方法不需要窄分布样品，其标样可为13个不同相对分子质量的宽分布标样（平均相对分子质量精确测量，Mw和Mn为已知），采用数学处理方法得到渐进试差法的校正曲线。,1、凝胶渗透色谱法测定聚氨酯树脂的平均相对分子质量,流动相：DMF，流速为1.0ml/min 进样量：100L；柱温：50。 标准工作曲线的绘制取重均相对分子质量为3.2110 3.0510的5种Ps标准样品，用DMF配制成系列浓度的标准溶液，然后用0.45m滤膜过滤，取滤液测试,求得Ps的标准工作曲线线性方程。,五、凝胶渗透色谱的应用,样品测定将聚氨酯树脂样品溶于DMF中，配制成2.00mg/mL的样品溶液，测定并绘制色谱图，求得样品的平均相对分子质量。,样品的保留时间值带入标准曲线线性方程，计算出样品的重均相对分子质量为8.10105 ; 样品的数均相对分子质量为3.00105 。,2、 高分子与低分子同时测定由于小分子和高分子的流体力学体积相差较大，因而GPC可以同时分析而不必进行预先分离。一般来说从高分子材料的GPC可以同时看到三个区域：A：高分子；B：添加剂和齐聚物；C：未反应的单体和低分子的污染物，如水。,(1) 环氧树脂中树脂和齐聚物的同时分析普通双酚A型环氧树脂有很宽的分子量范围 (高，中，低）。GPC能快速可靠地鉴别不同类型环氧树脂的分子量特性。,低、中和高分子量双酚A型环氧树脂的GPC谱图,色谱条件：四根微粒凝胶柱(7.7mm 250mm)，孔径分别为5、10、50和100nm，颗粒直径10m；280nm下UV检测；流动相为四氢呋喃，流速1mL/min；柱温为50；样品量为10L 0.2%0.5%溶液,三种不同分子量的GPC谱图如图所示，图上数字代表不同的聚合度n，树脂和齐聚物的峰形特征可用作指纹图，以区别不同厂家和批号的产品。,(2) 高分子材料中小分子的定性鉴别和其他色谱方法一样，GPC也可以用保留体积来鉴别或分离后用IR等方法鉴定中小分子物质。如果能预测某未知峰属于某种化合物，则将该化合物加入该试样中，比较前后的谱图变化，如果未知峰强化，则很可能就是该物质。,用强化法鉴别高分子材料中的小分子化合物的示意图,(1) 丁苯橡胶在塑炼时分子量分布的变化在塑炼过程中定时取样分析，结果如图。随时间的增加，高分子量组分裂解增加，GPC曲线向低分子量方向移动，经过25min以后，高分子量组分几乎完全消失。如果塑炼的目的就是消除该组分，那么25min足够了。通过GPC数据可以帮助工作人员确定塑炼时间。,3、 在高分子材料生产过程中的检测,经不同时间塑炼后的丁苯胶的GPC谱图塑炼时间为：0：0min；1：4min；2：5min；3： 25min；4：120min；5：180min,(2) 控制聚合反应的终点用GPC对聚合物进行中间反应分析，使生产人员能在达到预定的单体/聚合物比后即时终止反应。,用GPC对聚合终点控制分析的示意图 反应开始时全部是单体； 反应进行一半，部分单体部分聚合物； 反应终点，大部分是聚合物，单体/聚合物比为0.15,4、 高分子材料老化过程研究,可以研究高分子材料在使用过程中的老化，研究老化机理。以高密度聚乙烯HDPE为例，必须加适量抗氧剂以提高耐候性。,在耐候试验不同阶段的HDPE样品的GPC谱图 1-开始时；2-第一阶段；3-第二阶段；4-最后阶段,5、 高分子支化度的测定 表征高分子支化度的参数常用的是支化因子g：,显然对于相同分子量的高分子 ，所以支化程度越大，g越小。,另一个支化参数是G:,b 支化高分子的特性粘度； l 线型高分子的特性粘度。因为支化高分子的流体力学体积较小，所以b l，G 1。对于G和g之间有如下关系：G=g，对于无规轻度支化的高分子， =1/2。,如果给出保留体积，即流体力学体积相等的情况下，支化高分子的分子量大于线形高分子的分子量。测定时可用自动粘度计作为检测器，直接测得支化高分子每个级分的，即bi。对于同一级分，线型高分子的M与支化高分子的相等。,