第二节 基因突变及菌种选育,1,一、基因、基因符号以及有关术语,1、基因 是合成一条多肽或RNA所必需的完整的核酸序列。 2 、基因组、基因型是指生物单倍体细胞所有基因。基因组侧重“全部碱基对序列的组成”；基因型（genotype）是生物基因体现的功能、特性，侧重“某个基因”。,2,3 、基因符号常以说明某个基因功能特性的英文的前3个字母表示，一般用小写斜体，该基因的功能特性在右上角以/、r / s表示。组氨酸基因用his（histidine的前3个字母）表示，his - 表示组氨酸缺陷型；gal+、gal-分别表示能发酵半乳糖（galactose ）和不能发酵半乳糖；strs、strr分别表示对链霉素（streptomucin）敏感和具抗性。,基因座位(gene locus)指各个基因在染色体上特定的位置。,3,4、性状是构成一个生物个体的有关结构、形态、物质和功能等各方面特征的总称。5 、表型指微生物在特定条件下表现出来的某种生物学特性。,4,二、基因突变,（一）基因突变的术语 突变（mutation）DNA或RNA中核苷酸序列发生了稳定可遗传的变化，导致微生物性状发生改变。 基因突变（点突变）DNA链上一对或少数几对碱基发生改变。 染色体畸变DNA的大片段变化（插入，缺失，重复，易位、倒位等）,5,野生型菌株与突变型菌株野生型菌株，从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株。突变型菌株，野生型菌株经突变后，性状改变的菌株。 正向突变与回复突变正向突变 突变型菌株 回复突变 回复突变，野生型菌株经突变成为突变型菌株以后，经再一次突变，有时突变型菌株又恢复为野生型菌株原有的性状，则这次的突变被称为回复突变。,野生型菌株 （或野生型菌株的表型）,6,自发突变与诱发突变 自发突变，自然条件下发生的突变。 诱发突变，用各种人工因素处理细胞，突变率大大增加，这种突变称为诱变。 诱变剂，如紫外线、亚硝酸等。突变率，在生长的微生物群体中，每一细胞的某一性状在每一世代中独立发生突变的机率。一般也可简单地用每单位群体在繁殖一代过程中所形成的突变细胞平均数来表示。,7,1、形态突变 （1）细胞形态鞭毛，芽孢，荚膜有无，L型细菌。 （2）菌落形态大小，光滑和粗糙，颜色等，孢子颜色。一般为非遗传型的表型变异，肺炎球菌失去荚膜：SR 变形杆菌：2%琼脂，长鞭毛，薄膜状菌落；6%琼脂或0.1%碳酸形成单个生长的菌落。,（二）突变的类型（根据突变体表型来分）,8,2、致死突变 （1）基因突变导致个体死亡 （2）条件致死型e.g. 温度敏感突变型 E.coli 37生长，42下不生长，主要是突变引起了某些重要蛋白质结构和功能的改变。,9,3、抗性突变型 （1）抗药性（耐药性），可作为选择性标记。 （2）抗噬菌体。 4、抗原突变型抗原成分（eg. cell wall，鞭毛，荚膜，病毒表面蛋白等）的变异。 5、产量突变型通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。如产量显著高于原始菌株者为正变株，反之为负变株。,10,6、营养缺陷型（auxotroph）由于基因突变，而丧失合成一种或几种生长因子的能力，必须在培养基中添加相应的营养成分才能正常生长繁殖的突变型。（e.g. AA,vitamin） 野生型（wild type）：从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷型突变前的原始菌株。 原养型(prototroph)：一般指营养缺陷型突变株经回变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。,11,基本培养基（MM）能够满足野生型菌株生长最低限度需要的培养基。补充培养基（SM）凡能满足相应的营养缺陷型生长需要的培养基。在MM中加蛋白胨（多种氨基酸)便可以用来培养各种氨基酸的缺陷型；加入酵母浸膏(其中含有多种B族维生素和核苷酸)便可以培养不同的维生素、嘌呤和嘧啶缺陷型。完全培养基（CM）凡能满足一切营养缺陷型生长需要的培养基。,12,13,生物化学统一性法则：,人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。,化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。超过95的致癌物质对微生物有诱变作用 ，90以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。,诱变剂的共性原则：,（四）突变株的应用Ames试验,（遗传毒性试验之一）,14,美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1975年发明，因此称为Ames试验。,原理： 检测鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhmurium）组氨酸营养缺陷型菌株（his -）的回复突变率。,15,16,证明Ames试验重要性的应用实例：,上世纪 60-70年代，一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停” 流行。但随后发现畸形儿的出生率明显增高(海豹肢症)，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”。采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用。药品开发过程中，必须有“三致”实验的数据，才能够获得批准。 目前，在临床医生的严格指导下，我国众多皮肤科、免疫科和肿瘤科的患者正在接受着“沙利度胺”“反应停”的治疗。,17,18,（二）基因突变的主要规律,1、自发性和不对应性 2、稀有性：环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为10-610-9 。 3、诱发性：某些物理、化学因素对生物体的DNA进 行直接作用，突变以较高的频率产生。（诱变剂仅 起着提高诱变率的作用） 4、独立性：某个基因的突变是一独立事件，对其他 基因的突变几率没有影响。 5、稳定性 6、可逆性,19,变量实验（fluctuation analysis） Salvador Luria & Max Delbrck（1943）,20,影印平板法常用于营养缺陷型的鉴别、分离。,21,22,若干细菌某一性状的自发突变率,菌 名 突变性状 突变率 E. coli 抗T1噬菌体 3108 E. coli 抗T3噬菌体 1107 E. coli 不发酵乳糖 11010 E. coli 抗紫外线 1105 Staphylococcus aureus 抗青霉素 1107 S. aureus 抗链霉素 1109 Salmonella typhi 抗25g/L链霉素 1106 Bacillus megaterium 抗异烟肼 5105,23,三、基因突变的分子机制,（一）自发突变的分子机制 1、低剂量诱变因素的长期综合效应外源性诱变因素：各种辐射、环境中低浓度诱变 剂、高温、宇宙射线等 (量效关系)内源性诱变因素：各种代谢物（如H2O2、咖啡碱、 硫氰化合物）、转座因子 2、碱基结构的变化 AT； GC。据统计，碱基对发生自发突变的几率约为10-810-9。 T（酮式）变为 T（烯醇式），则TG。5-MeC自发脱氨作用。,24,酮式烯醇式互变异构 胺式亚胺式互变异构,25,26,27,3、环出效应,DNA,10,2,3,4,5,6,7,8,9,1,10,2,3,4,5,6,7,8,9,1,10,2,8,9,1,10,2,3,4,5,6,7,8,9,1,序列3和序列7配对成环,28,29,碱基结构的变化,30,（二）诱发变异的机制,1、化学诱变剂引起的突变 （1）碱基对直接置换（即一对碱基被另一对碱基所置换,分为转换和颠换。）如：常用的亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。亚硝酸的诱变机制,使碱基发生氧化脱氨，腺嘌呤A变成次黄嘌呤H，胞嘧啶C变成尿嘧啶U。,能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有。,31,32,腺嘌呤经氧化脱氨后变成烯醇式次黄嘌呤（He），He通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（HK） 。 DNA双链第一次复制，结果Hk在6位上含有酮基，故只能与6位上含有氨基的胞嘧啶C配对。 DNA双链第二次复制，其中胞嘧啶（C）正常与鸟嘌呤（G）配对，使A-T G-C ，从而实现转换。 当胞嘧啶被氧化成尿嘧啶（U）时，也可实现G-C A-T 。,33,AT GC,34,GC AT,35,碱基置换在编码蛋白的基因中的可能作用：DNA单一密码子的改变产生不同的蛋白。,36,（2）碱基类似物引起的间接置换（5-BU，5-AU， 8-NG）,5-BU是T的结构类似物，一般以酮式状态存在，可与A配对；有时以烯醇式状态存在，当DNA进行复制时，就只能与G配对。G再正常的与C配对，完成A-T转换成G-C。,37,38,硝酸与5-BU的诱变机制异同,39,（3）移码突变（frame-shift mutation）,一种诱变剂引起DNA分子中一个或几个核苷酸的增加或缺失，从而造成突变点以后的全部遗传密码的转录和翻译都发生错误。例，原黄素、吖啶黄等吖啶类染料均可引起移码突变，增加一个碱基的距离，3.4。,40,41,42,诱变因素 在DNA上的初级效应 遗传效应 碱基类似物 掺入作用 AT=GC双向转换羟 胺 与胞嘧啶起反应 GCAT的转换亚硝酸 A、G、C的氧化脱氨作用 AT=GC双向转换交 联 缺失 烷化剂 烷化碱基（主要是G） AT=GC双向转换烷化磷酸基团 ATTA的颠换丧失烷化的嘌呤 GCCG的颠换糖-磷酸骨架的断裂 巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）丫啶类 碱基之间的相互作用（双链变形） 码组移动（或）紫外线 形成嘧啶的水合物 GCAT转换形成嘧啶的二聚体 码组移动（或） 交 联 电离辐射 碱基的羟基化核降解 AT=GC双向转换DNA降解 码组移动（或） 糖-磷酸骨架的断裂 巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）丧失嘌呤 加热 C脱氨基 CGTA转换Mu噬菌体 结合到一个基因中间 码组移动,若干诱变剂的作用机制及诱变功能（往往不止单种功能）,43,四、突变的修复,*以紫外线照射形成的胸腺嘧啶二聚体的修复为例,44,1. 光复活经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。光复活酶，又称光裂解酶,45,2. 暗修复主要指切除修复。是细胞内的主要修复系统。,46,3、重组修复这是在DNA复制时进行的一种越过损伤的修复。,47,一般认为，SOS修复系统是紫外线诱发突变的主要原因。,4、SOS修复指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式。修复结果只是能维持基因组的完整性,提高细胞的生成率,但留下的错误较多,使细胞有较高的突变率。,48,三、菌种选育,（一）自发突变与育种从生产中选育、定向培养优良菌种（卡介苗(BCG)是法国科学家Calmette和CGuerin经历了l3年时间，把牛型结核分支杆菌接在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上，连续转接了230代，才在1923年成功地获得。）特点：自发突变频率很低，培育新种的过程十分缓慢,