第十一章 生物素亲和素免疫放大技术,姚 军 台州学院医学院医学检验系,Dr. Yao Jun, Faculty of Laboratory Medicine in Taizhou College,概述：,70年代后期在免疫酶技术中利用生物素-亲和素系统(Biotin-Avidin System BAS)标记抗体发展了又一种新型生物反应放大技术,维生素H 动、植物组织中广泛分布,卵黄和肝含量高 MW 244.31kD,I 咪唑酮环, 噻吩环,羧基,第一节 生物素理化性质与标记,生物素（Biotin)有两个环状结构 I环（咪唑酮环）为与亲和素结合的主要部位 II环（噻吩环）为结合抗体和其它生物大分子的部位，C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构,选择题,生物素分子中与亲和素结合的重要部位是（ ） A.咪唑酮环 B.苯环 C.吩噻环 D.羰基 E.-NH-,A,一、活化生物素,生物素侧链的末 端羧基经化学修 饰后制成带各种 活性基团的衍生 物活化生物素 (生物素化衍生物),II环为噻吩环，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的惟一结构，经化学修饰后成为活化生物素,用活性生物素标记的物质，下列哪项除外（ ） A.蛋白质的氨基 B.蛋白质的羧基 C.蛋白质的巯基 D.蛋白质的醛基 E.核酸,选择题,B,活化生物素,标记蛋白质氨基的活化生物素,BNHS分子可与蛋白质赖氨酸的氨基形成肽键 BNHS适用标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质,生物素,N-羟基丁二酰胺,碳二亚胺,生物素N- 羟基丁二 酰亚胺酯 （BNHS ）,如何减小空间位阻？ 长臂活化生物素（BCNHS）： 生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添 加了两个6-氨基已糖分子基团，形 成连结臂，以减少位阻效应的影响,长臂活化生物素 (BCNHS) 是在生物素和 N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个 6- 氨基己糖分子基团，形成连结臂， 使其与抗体、酶等生物大分子结合后，不受位阻效应的影响, 更易发挥生物素的活性作用,4.常用于标记抗体的活化生物素是（ ） A.BNHS B.BHZ C.BCNHS D.BCHZ E.MPB,选择题,A,标记蛋白质醛基的活化生物素,生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白(Ag) 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接后，再与无水肼反应而成。除醛基外， BCHZ还可标记氨基,.常用于偏酸性抗原标记的生物素是（ ） A.BNHS B.BHZ C.BCNHS D.BCHZ E.MPB,选择题,B,标记蛋白质巯基的活化生物素,马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB) 能特异地与蛋白质巯基结合的活化 生物素,标记核酸的活化生物素,光生物素(photobiotin)侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后, 变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合, 形成B（生物素）-核酸探针,生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）作为TTP（三磷酸胸苷）的结构类似物，可 采用缺口移位法掺入到双链DNA中,BNHS和BHZ 可直接标记核酸， 但对碱基配对有影 响（影响氢键的形成）,活化生物素通过侧链与蛋白分子连接 一个蛋白分子可被多个生物素标记多价性 对BNHS多标记抗体, BHZ则多标记偏酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变 可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后活性将降低,二、生物素标记蛋白质,选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性 控制生物素:蛋白质比例 生物素:IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1 IgG应用浓度0.55g/ml 13个生物素/1个Ag，35个生物素/1个Ab 使用交联臂减少空间阻力,第二节 亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记,亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合物 二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合,亲和素（Avidin)耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，与生物素 结合后稳定性更好。每个亲和素能结合四个分子的生物素,生物素（Biotin, B）,结构 四亚基糖蛋白 四肽链蛋白 无糖基 pI 10.5 6 结合位 色氨酸 色氨酸 生物素 4 4 K（亲和常数） 1015 1015 活性(U) 1315 1518,亲合素（A）,链霉亲合素(SA),一、理 化 特 性,二、亲合素/链霉亲合素标记,标记物：酶、胶体金异硫氰酸荧光素（FITC） HRP-AV(SA)改良过碘酸钠法、戊二醛法 ABC/SABC 预制亲和素(AV)-Biotin、链霉亲和素(SAV)-Biotin,第三节 生物素-亲合素系统的特点,一、灵敏度 二、特异性 三、稳定性 四、适用性 五、其他,灵敏度高 其反应呈高度专一性 稳定性高 适用范围广 实验成本低,第四节 生物素-亲合素系统的应用,生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强 生物素与亲合素各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性 使BAS及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献,一、生物素-亲合素系统基本类型及原理,BAB法（亲和素-标记生物素法）： 特点：以游离亲和素为桥臂，分别连接生物素化抗原（或抗体）和标记生物素（如酶标生物素）,返回,+A,+A,亲和素-标记生物素法（BAB法）：先使抗原与生物素（B）化的抗体结合，再以游离亲合素(A)将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果,亲合素(A),生物素化的抗体,酶标生物素,底物,选择题,BAB法中的“桥”是指（ ） A. 第一抗体 B.第二抗体 C.抗原 D.生物素 E.亲和素,E,BA法（标记亲和素-生物素法） 特点：以标记亲和素/标记链霉亲和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的游离亲和素（A），省却了加标记生物素（B-E）的步骤,BAB法（亲和素-标记生物素法）： 特点：以游离亲和素为桥臂，分别连接生物素化抗原（或抗体）和标记生物素（如酶标生物素）,+A-E,BA法（标记亲和素-生物素法）：以标记亲和素/标记链霉亲和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的亲和素（A），省却了加标记生物素（B-E）的步骤,A-E,+,B-E + A ABC,ABC法特点:将BAB法中的A（亲和素）先与B-E（酶标生物素）结合，制备成复合物ABC（亲和素-生物素-过氧化酶复合物）,ABC法 原理示意图,特点：将BAB法中的A（亲和素）先与B-E（酶标生物素）结合，制备成复合物ABC,+ABC,Ab-Ag-Ab-B + ABC Ab-Ag-Ab-B-ABC,预先按一定比例将亲和素（或链霉亲和素）与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素（或链霉亲和素）-生物素-过氧化物酶复合物（ABC或SABC）。当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，ABC（或SABC）复合物中未饱和的亲和素（或链霉亲和素）结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原-抗体反应体系与ABC（或SABC）标记体系连成一体进行检测,方法应用,BSA在酶免疫测定中的应用 BSA在荧光免疫技术中的应用 BSA在放射免疫测定中的应用 BSA在分子生物学中的应用,二、亲合素/链霉亲合素标记,标记物：酶、胶体金异硫氰酸荧光素（FITC） HRP-AV(SA)改良过碘酸钠法、戊二醛法 ABC/SABC 预制亲和素(AV)-Biotin、链霉亲和素(SAV)-Biotin,二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中的应用,BAS在ELISA中的应用 生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定,BAB-ELISA夹心法测抗原的原理：用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗体，与已与固相抗体结合的抗原抗体复合物结合，然后连接亲和素及酶标生物素，从而使反应信号放大，提高检测灵敏度,三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中的应用,BAS用于荧光抗体技术 通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素） 游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（BAB法） 荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素）抗体的夹心法,四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中的应用,BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶联，用于对终反应的放大（BA法） BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离,五、生物素-亲合素系统在分子生物学中的应用,以生物素标记核酸探针进行的定位检测 用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化 将免疫测定技术与PCR结合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测,思考题,1.简述几种常用于标记不同类型生物大分子的活化生物素？,标记蛋白质氨基的活化生物素，如BNHS，BCNHS。 标记蛋白质醛基的活化生物素，如BHZ，BCHZ。 标记蛋白质巯基的活化生物素，如MPB。 标记核酸的活化生物素，如光生物素。,思考题,2.简述常用于标记核酸分子的活化生物素有哪几种？,光生物素：是一种化学合成的衍生物，用于DNA或RNA的标记 生物素脱氧核苷三磷酸：先将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素，再采用缺口移位法而掺入到双链DNA中 BNHS和BHZ：二者均可在一定条件下与核酸胞嘧啶分子中的N4氨基交联，使核酸分子生物素化,思考题,3.简述BAS在应用中的二种基本类型。,BAS在反应中的基本类型有二种: 一类以游离亲和素为中间物,分别连接包含生物素化大分子的待检反应体系和标记生物素,称为BAB法;后来又在此基础上发展了亲和素-生物素化酶复合物技术(ABC) 另一类是直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BA法，或称标记亲和素-生物素法（LAB）,谢谢！,