第四章 抗体制药,第一节 概述,一.抗体工程与抗体药物1890年Behring（培林）和北里柴三郎发现白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了抗体制药。1937年Tiselius（提赛留斯）用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白、球蛋白，并证明抗体活性主要存在于球蛋白组分。,抗体是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。抗体的产生：机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。,20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白， 统称为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化学结构的概念，而抗体是生物学功能的概念。,抗体与细菌、病毒或毒素等抗原结合，通过下列3种或其中一种方式综合和除去有害物质： 1.直接使抗原失去活性 2.使免疫效应细胞将其吞噬并加以破坏 3.使抗原表面弱化从而易于受补体破坏,多克隆抗体：病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体。早期采用的抗体药物主要为多克隆抗体，虽然其在治疗多种急性中毒中仍发挥重要的作用，但是多克隆抗体存在非均一性、异质性、不稳定性等缺点。,1975年Kohler（乔治科勒）和Milstein（凯撒米尔斯坦）首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体（monoclonalantibody McAb）。单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提供了全新的手段，还促进了基础和临床医学的发展。,单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要用与疾病的诊断和治疗。单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。,单克隆抗体用于临床治疗，CD3单克隆抗体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑制作用。以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定向治疗（抗体“导弹”即为靶向制剂）。,二、抗体药物的特异性,单克隆抗体针对特定的单一抗原表位，具有高度的特异性，这是抗体药物发挥治疗作用的重要基础。对于抗肿瘤抗体药物的研究表明，其特异性主要表现在：1.与相关抗原的特异性结合2.对肿瘤靶细胞的选择性杀伤3.在动物体内呈靶向性分布4.对相关的肿瘤显示更强的疗效,三、抗体药物的主要研究方向,1.研究新的分子靶点 2.免疫检测技术的研发 3.抗体的人源化 4.抗体药物分子的小型化 5.具有抗体功能的融合蛋白,第二节 单克隆抗体及其制备,单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。,一、抗原与动物免疫制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。有的抗原可以用化学合成：地高辛多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。,为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞供体应为同一品系动物进行免疫。目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c品系小鼠和 LOU品系大鼠，因此免疫动物也采用相应的品系。,免疫的方法采用体内免疫法和体外免疫法。体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用812周龄雌性鼠。颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔10个细胞进行初次免疫，间隔13周，再追加免疫12次。,7,可溶性抗原按每只小鼠10100g抗原与弗氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔24周，再用不加佐剂原抗原追加免疫12次。一般再采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原。刺激B细胞分裂。,注： 1、弗氏完全佐剂是一种油包水的乳浊液，能够非常有效的诱导产生高滴度的抗体。弗氏完全佐剂含结核分枝杆菌的细胞壁成分，可以加强对抗原的抗体反应。佐剂活性来自于油滴中免疫原的持续释放，并刺激局部免疫反应。简单的说，这个注射入哺乳动物皮下之后，会产生炎症和疼痛。 2、弗氏完全佐剂一般由石蜡油、羊毛脂和灭活的分枝杆菌（卡介苗）组成的。,脾内免疫法即在麻醉下直接将 0.10.2ml抗原注入脾脏进行免疫。一般细胞抗原需105个，可溶性抗原需10g。,体外免疫法用于不能采用体内免疫的情况下，如：制备人源性单克隆抗体；抗原免疫源性极弱，易引起免疫抑制。优点：需抗原量少，免疫期短，干扰因素少。,体外免疫法：用48周龄BALB/c小鼠的脾脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.55g/ml,在5% CO 37 C 下培养45天,再分离脾细胞,进行细胞融合。,o,2,o,二、细胞融合与杂交瘤细胞的 选择性培养1.骨髓瘤细胞的选择应尽可能选择自身不合成或至少不分泌任何免疫球蛋白分子或片段的骨髓瘤细胞作为亲本细胞。细胞必须处于良好的生长状态，对数生长期最好。2.免疫脾细胞悬液的制备取经免疫的小鼠，摘除眼球放血，将小鼠处死，无菌摘取脾脏，研磨制取脾淋巴细胞悬液，洗涤调整细胞浓度。,3.细胞融合的方法：脾细胞（1108）与骨髓瘤细胞（2107）混合，聚乙二醇（ PEG）诱导下融合，2分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。PEG相对分子量4000，浓度为50%，DMSO（二甲基亚砜）增加融合率，时间不宜过长。,细胞融合后可产生多种融合：脾脾、脾瘤、瘤瘤融合细胞；还有为融合的脾细胞和为融合的瘤细胞。选择性培养:培养基 为HAT培养液。 次黄嘌呤(H)、氨甲喋呤(A)、胸腺嘧啶(T)配制而成。A阻断DNA合成。,脾细胞在一般情况下不能连续培养。骨髓瘤细胞都是HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）缺乏株，不能利用H和T合成DNA,而脾细胞中有这种酶，所以只有脾瘤才能在HAT选择培养基上生长。,三、筛选阳性克隆与克隆化筛选阳性克隆常用检测方法：1、免疫酶技术2、免疫荧光技术3、放射免疫技术应根据实验室条件及抗原的情况选择合适的方法。,ELISA原理,ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原 或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用 洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上 。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物 质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很 高的敏感度。,ELISA用于破伤风抗体的筛选,克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。这种群体细胞的生物学特性和功能完全相同。常用方法：有限稀释法和软琼脂培养法,四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 1. 杂交瘤细胞鉴定：染色体分析、抗体稳定性分析、外原因子检查。2. 单抗进行Ig类和亚类鉴定：用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA鉴定。3. 亲和力常用方法：相对亲和力测定,4. 纯度含量测定纯度一般用层析法测定 5. 活性测定测效价 6. 识别抗原位点测定 7. 特异性、交叉反应性测定,五、单克隆抗体的大量制备目前制备的方法主要有两种：动物体内诱生法和体外培养法 1.体内诱生法：可获的520mg/ml抗体，用BALB/c小鼠。降植烷 接种杂交瘤细胞 取腹水 离心 上清。,2.体外培养法目前工业化生产常用方法， 体外培养法可获的10g/ml抗体。动物细胞培养技术发展非常迅速，越来越多用于单克隆抗体的生产。,六、单克隆抗体的纯化依单抗IgG类和亚类不同，选各种不同的纯化方法。体内诱生法单克隆抗体的纯化方法： 1、离心，取上清，超滤，盐析。 2、分离 ：凝胶过滤用于IgG IgM单抗纯化。阴离子交换层析IgG单抗纯化。亲和层析 IgG单抗纯化。,第三节 抗体诊断试剂,一、血清学鉴定用的抗体类试剂 鉴定病原菌的抗体试剂常用诊断血清的品种和用途沙门氏菌属诊断血清志贺氏菌属诊断血清病原性大肠埃希氏菌诊断血清,诊断血清的制备步骤制备细菌抗原免疫动物和制备抗体血清 诊断血清诊断方法,乙型肝炎病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂 妊娠诊断试剂 抗ABO血型系统血清,若将血型不相容的两个人的血滴放在玻片上混合，其中的红细胞即聚集成簇，这种相容称为凝集（agglutination）。红细胞的凝集有时还伴有溶血。当血型不相容的血液输入循环血液中时，在血管内可发生同样的情况，此凝集成簇的红细胞可以堵塞毛细血管，溶血将损害肾小管，同时常伴发过敏反应，其结果可危及生命。红细胞膜上的一些特异糖蛋白，在凝集反应中糖蛋白起着抗原的作用，因而称它们为凝集原（agglutinogen）。能与红细胞膜上的凝集原起反应的特异抗体则称为凝集素（agglutinin）。,ABO血型是根据红细胞膜上存在的凝集原A与凝集原B的情况而将血液分为4型。凡红细胞只含A凝集原的，即称A型；如存在B凝集原的，称为B型；若A与B两种凝集原都有的称为AB型；这两种凝集原都没有的，则称为O型。不同血型的人的血清中各含有不同的凝集素，即不含有对抗他自身红细胞凝集原的凝集素。在A型人的血清中，只含有抗B凝集素；B型人的血清中，只含有抗A凝集素；AB型人的血清中没有抗A和抗B凝集素；而O型人的血清中则含有抗A和抗B凝集素,二、免疫标记用的抗体试剂,荧光抗体诊断试剂荧光抗体的制备免疫荧光测定方法直接法和间接法,三、导向诊断药物,1.放射性核素标记抗体，肿瘤放射免疫显像定位技术2.放射免疫显像优点：在体内确切肿瘤定位作用，准确性达90%，灵敏度达100%。在体内可检出0.5cm大小的病灶，并可检出肺脑的转移灶。,小分子抗体易到达肿瘤部位，可显著提高N/NT值。 抗体在肿瘤部位可保留69日 能观擦抗体在血中的半衰期和可能出现的不良反应。,放射免疫显像定位技术原理：将单克隆抗体（Ab）与二乙基三胺五乙酸（DTPA）在体外偶联成Ab-DTPA，再注入体内后，就能与体内组织相结合。由于抗体分子量大，需3天完成。3天后注入放射性核素In-113M，因DTPA是重金属离子络合剂，所以In-113M可以结合到DTPA分子上，使肿瘤组织显像。这一过程在2小时内可完成。,建立预定位技术需解决3个问题：抗体在肿瘤组织滞留要7天以上。 Ab-DTPA偶联物比较稳定；内源性金属离子对DTPA的封闭作用要小。,以抗体为载体的导向治疗药物，还不成熟。 一、放射性核素标记的抗体治疗药物抗体作为放射性核素的导向载体，标记操作简便，用量小。放射性核素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大。,第四节 抗体治疗药物,二、抗癌药物偶联的抗体药物常用的抗癌药物氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、丝裂霉素（MMC）等。以人血浆白蛋白作为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的MTX量，使体外细胞毒性体高二倍。,三、毒素偶联的抗体药物在导向药物中，毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。免疫毒素的临床应用：治疗肿瘤、自身免疫病，并能克复组织移植排斥反应，可单独给药，也可包裹在脂质体及其它微粒中给药。,