五种菊花近缘植物组织培养研究五种菊花近缘植物组织培养研究摘要： 以紫花野菊变种、纪伊潮菊、龙脑菊、那贺川野菊和矶菊 个菊花近缘种属植物无菌苗为试材， 进行了茎段离体快繁体系和离体叶片不定芽再生体系研究。结果表明： 最佳茎段增殖培养基分别为：紫花野菊变种， MS . mg L BA （. .） mg L IBA ； 纪伊潮菊， MS . mg L KT . mg L NAA ； 龙脑菊， MS . mg L KT . mg L NAA ； 那贺川野菊， MS . mg L KT . mg L NAA ； 矶菊， MS . mg L BA . mg L NAA 。紫花野菊变种、纪伊潮菊、龙脑菊、那贺川野菊试管苗适宜生根培养基是MS ； 矶菊试管苗适宜生根培养基为MS . mg L NAA 。 个材料试管苗离体叶片愈伤组织诱导率均较高，但不定芽的诱导率则因基因型而异，仅那贺川野菊和矶菊能诱导出不定芽。那贺川野菊在MS . mg L KT . mg L NAA培养基上不定芽的再生率和增殖系数均最高，分别为. 和. ； 而矶菊在MS . mg L BA . mg L NAA 培养基上的不定芽再生率和增殖系数最高，分别达. 和. 。关键词： 菊花近缘植物； 茎段； 叶片；组织培养菊花近缘种属野生资源具有抗虫、抗病、抗逆等优良性状， 对栽培菊花的品种改良、抗性育种等种质创新十分重要， 同时也是进行菊属亲缘关系探讨和栽培菊花起源研究的重要材料。但来自不同生态类型的菊花近缘野生材料在越夏或越冬时难以存活， 造成种质资源严重丢失。植物组织培养技术已广泛应用于种质资源保存和离体快繁。自 Hill （） 利用芽尖外植体通过愈伤组织诱导成株建立菊花再生体系以来， 许多学者以叶片 、茎段 、管状花 、花梗 等为外植体相继建立了菊花的离体再生体系， 原生质体培养 和体细胞胚培养再生体系 也获得了成功， 但有关菊花近缘野生物种组织培养研究鲜见报道。本试验以引自日本的具有抗虫性、耐盐性、耐水湿等优良性状的 种野生材料紫花野菊变种（Dendranthem a z aw adskii var.latilobum） 、纪伊潮菊（A j ania shiwogiku var.kinokuniense） 、龙脑菊（D.j aponicum） 、那贺川野菊（D.yoshinaganthum） 、矶菊（A.p acificum） 为试料， 探讨了不同生长调节剂组合和培养基种类对试管苗增殖、离体叶片愈伤组织诱导、不定芽再生以及试管苗生根的影响， 初步建立了 种供试菊花近缘野生植物的离体快繁体系和不定芽再生体系，为该类具优良抗性性状野生资源的保存和利用奠定了基础。1 1 材料与方法材料与方法1.11.1 材料材料 种供试菊花近缘野生材料（表） 均从日本收集， 保存于南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心” 。表1 5 种菊花近缘野生材料代号 Code中文名染色体数目花色RG紫花野菊变种 n x 白色 粉色ZB纪伊潮菊 n x 黄色ZB龙脑菊 n x 白色ZB那贺川野菊 n x 白色 粉色ZB矶菊 n x 黄色1.21.2 5 5 种菊花近缘野生植物离体快繁体系的建立种菊花近缘野生植物离体快繁体系的建立1.2.1 不同植物生长调节剂组合对增殖的影响 选取生长健壮的无菌苗， 切割成带 个节的节段，接种到增殖培养基中诱导不定芽， 共设 个处理（表） 。每处理接种 个外植体， 次重复。培养 d 后统计增殖系数。增殖系数 （增殖后芽总数 接种芽数） 接种芽数（注： 接种后死亡芽数不计入） 。1.2.2不同基本培养基对生根的影响 将增殖培养诱导的健壮不定芽切割成带 个叶片、长. . cm 的茎段， 分别接种至MS 、 MS 培养基中进行生根诱导。每处理 瓶， 每瓶接种 个外植体。 d 后统计生根苗数及平均根数， 测量根长， 计算生根率。1.2.3 不同生长素种类及浓度对生根的影响 外植体的切取方法同. ， 分别接种于添加. 、. 、. mg L 的NAA （萘乙酸） 或IBA （吲哚丁酸） 的 MS 培养基上， 以不添加生长素的 MS 培养基为对照。每处理 瓶， 每瓶接种 个外植体。统计项目与方法同. 。1.31.3 5 5 种菊花近缘野生植物叶片不定芽再生体系的建立种菊花近缘野生植物叶片不定芽再生体系的建立1.3.1 不同细胞分裂素对叶片愈伤组织诱导和不定芽分化的影响将无菌苗叶片切成. cm . cm左右的小块作为外植体， 分别接种到添加不同种类及不同浓度细胞分裂素的MS 培养基中（ BA （苄基腺嘌呤） ： . 、. 、. mg L ； KT （激动素） ： . 、. 、. mg L ） ， 再添加. mg L NAA 。每处理 瓶， 每瓶接种 个叶片外植体。 d 后统计愈伤组织诱导率， 再将愈伤组织转接于相同的培养基中， d 后统计叶片再生率和增殖系数。愈伤组织诱导率 形成愈伤组织的叶片数接种叶片总数 ； 叶片再生率 发生分化的叶片数接种叶片总数 ； 增殖系数 叶块发生的不定芽总数接种叶块总数。1.3.2不同生长素对叶片愈伤组织诱导和不定芽分化的影响 外植体的切取方法同. ， 将其接种到添加. mg L BA 及不同种类及不同浓度生长素（NAA ： . 、. 、. mg L ； ， D（ ， 二氯苯氧乙酸） ： . 、. 、. mg L ） 的MS 培养基中。每处理 瓶， 每瓶接种 个叶片外植体。愈伤组织诱导率、叶片再生率和增殖系数统计方法同. 。1.41.4 培养条件培养条件培养基均添加 g L 蔗糖、. g L 琼脂， pH 为. ， 高压高温灭菌 min 。在（ ） 、光照 h d 、光照强度 mmol m s 条件下培养。1.51.5 数据处理数据处理数据统计分析采用Microsoft Excel 和SAS 软件处理， 多重比较采用Duncans 检验法。2 2 结果与分析结果与分析2.12.1 不同植物生长调节剂组合对芽增殖的影响不同植物生长调节剂组合对芽增殖的影响 种菊花近缘野生植物带芽茎段接入增殖培养基第 天发现茎段切口处开始膨大， 有隆起的愈伤组织形成， 第 天开始有黄绿色丛生芽形成。各个种愈伤组织及不定芽的形成时间先后相差 d ， 其中， RG 最先形成愈伤组织， 而ZB 最先分化不定芽。同时， 每个种最适的增殖培养基表现出明显的基因型差异。由表 可知， RG 在. mg L BA 、. 和. mg L IBA 时， 增殖系数较高， 分别为. 和. ， 与其他处理之间存在显著差异，因此， MS . mg L BA （. .）mg L IBA 是RG 的优选增殖培养基（图A） 。ZB 在MS . mg L BA . mg L NAA 中增殖系数最高，达. （图 B） ； 在MS . mg L KT . mg L NAA 和MS . mg L KT . mg L NAA 中增殖系数也较高， 分别为. 和. ， 与其他培养基之间差异显著， 但三者间差异不显著。其中， ZB 在MS . mg L KT . mg L NAA 中分化的不定芽高度适中、节间均匀、茎充实健壮， 生长状态良好。ZB 各处理间的增殖系数差异较大， 除处理 和处理 之间差异不显著外， 其他均差异显著， 以MS . mg L KT . mg L NAA 的增殖系数最高，达. （图 C） 。ZB 各处理间除处理 和处理 外， 其他差异均显著， 以MS . mg L KT . mg L NAA 增殖效果最佳， 增殖系数达. （图 D） 。ZB 在各类培养基上的增殖系数均较低， 但 BA 比KT 更有利于ZB 增殖， 其中MS . mg L BA . mg L NAA 的增殖系数最高， 达. （图 E） 。图1 不同培养基对试管苗生长的影响2.22.2 不同基本培养基对试管苗生根的影响不同基本培养基对试管苗生根的影响 种菊花近缘野生植物在 MS 和MS 基本培养基上均能生根， 且在生根率、平均根数和平均根长方面， 两者差异不显著（表 ， 图 F 、G） 。但供试材料试管苗在 MS 培养基中的根系明显粗壮， 根毛多， 小苗长势健壮， 与多种植物试管苗生根要求较低无机盐浓度的结果相似， 且可以降低培养基成本。2.32.3 不同生长素种类及其浓度对试管苗生根的影响不同生长素种类及其浓度对试管苗生根的影响由表 可知， 种菊花近缘野生植物各处理间的生根率差异不显著。培养基中添加不同浓度的NAA 与IBA 对RG 、ZB 、ZB 试管苗生根数的作用不明显， 对RG 、ZB 、ZB 试管苗平均根长也没有显著性影响。与对照相比， IBA 对ZB （图 H） 和ZB 试管苗促进生根作用不显著， 而不同浓度NAA 对ZB 的生根有一定的抑制作用， 浓度越大抑制作用越明显（图 I） ； ZB 在NAA 为.mg L 时生根数显著高于对照， 但NAA 在 . mg L 时与对照差异不显著， 表明NAA 只有达到较适浓度才能起作用， 在一定范围内， 浓度越大， 促进作用越明显。对ZB 和ZB 而言， 添加NAA时其平均根长显著低于对照， 但添加IBA 对其平均根长没有显著影响， 仅. mg L IBA 对ZB 根伸长存在明显抑制作用。综合认为， MS 培养基是RG 、ZB 、ZB 、ZB 生根的适宜培养基，ZB选用 MS . mg L NAA 更适合。2.42.4 不同植物生长调节剂种类及浓度对离体叶片愈伤组织诱不同植物生长调节剂种类及浓度对离体叶片愈伤组织诱导的影响导的影响2.4.1 不同细胞分裂素种类及浓度对离体叶片愈伤组织诱导的影响 叶片外植体接种培养 d 后， 切口边缘开始膨大， 叶片逐渐增厚； d 后， 在切口边缘观察到黄绿色的愈伤组织。RG 、ZB 和ZB 愈伤组织诱导较容易， 而ZB 和ZB 相对较难。由表 可知， 在添加不同种类及浓度的细胞分裂素后，RG 、ZB 和ZB 的愈伤组织诱导率达. . ，