1,血细胞分析仪维修与开发技术,2,血液是维持人体正常生理活动的重要物质，它向全身各组织供应氧气，调节各器官的生理活动，抵御有害物质和病菌的侵害，常称为“生命之河”。人类生理和病理的变化，往往会引起血液组份的变化，可为医生提供诊断与治疗疾病的重要依据。血细胞计数与分析就是了解血液组份的一种方法，它已成为各级医院进行血液常规检验的必做项目之一。,3,1、血液的组成、特点及血细胞计数参数 血液由血浆和血细胞组成，血浆是血液的液体部分，除了水分之外，还有许多化学物质。血细胞包括红细胞、白细胞和血小板，其中红细胞的数量最多。血浆的基本组成如下表,4,人类生理或病理的变化与血液组份的变化息息相关，及时了解血液组份的变化，可为疾病的诊断、治疗提供重要依据。血液由血细胞和血浆组成，血细胞包括红细胞、白细胞和血小板，其中血细胞计数是指计数单位容积中红细胞、白细胞和血小板的数量，是了解血液组份的方法之一。所谓血细胞计数主要是指计数单位容积中红细胞、白细胞和血小板的个数。 红细胞在人体内的主要功能是携带氧气和部分二氧化碳，参与人体的气体交换。红细胞的数量最多，,5,成人男子红细胞的个数为旧制4.26.2106个/l，新制4.26.21012个/L；成人女子红细胞的个数为旧制4.25.4106个/l，新制4.25.41012个/L；红细胞的直径在69m之间，平均为7.2m血红蛋白存在于红细胞内，是红细胞的主要成分，其功能是结合氧气或部分二氧化碳，正常参考值成年男性为：120一160 gL，成年女性为：110150 gL。,6,白细胞：被成为人体卫士，它可以防止外来微生物的侵害及其他感染。白细胞分5类：中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞。正常人的白细胞数目为旧制4.010.0103个/l，新制4.010.0109个/L； 血小板有凝血和止血的功能。正常人的血小板数目为旧制1.03.0105个/l，新制1.03.01011个/L；平均直径23m。,7,机体的某些病变，可通过血细胞计数反映出来。如贫血时，红细胞计数、血红蛋白浓度会低于正常参考值；化脓感染、急性炎症、组织坏死、肿瘤、急性失血时白细胞计数会高于正常参考值；病毒感染、某些药物或经常接触放射性物质会使白细胞计数低于正常参考值。又如，血小板低于（2050） 109L会引起出血性疾病，而大于 1.0 1012L又易形成血栓。总之计数血细胞显得非常重要，临床上称之为血液常规。,8,传统的人工计数是将血液稀释后滴在血细胞计数盘，在显微镜下肉眼观察。这种方法效率低，计数精度低，误差因人而异，通常在（510）之间。随着检验工作量的增加和对精度要求的提高，这种传统方法远不能满足实际工作需要。50年代，随电子工业和计算机技术的发展，细胞计数器便应运而生，细胞计数器是实现细胞计数的一种仪器。初期的计数器只计数红细胞、白细胞，称细胞计数器（Cell Counter），后来增加了一个光电比色系统测定血红蛋白。,9,随着电子计算机的普及、发展和应用，细胞计数器的分辨能力进一步提高，除了红细胞、白细胞计数外还可以对血小板进行计数，还能计算出红细胞指数，共可得到 8个参数，称全血计数（Complete blood count ,CBC）。 随着特殊溶血剂的应用，能将白细胞按体积分为23分群，即淋巴细胞、粒细胞和中间细胞群。这样，细胞计数检测的项目可多达18项，甚至在实现白细胞五分类后，细胞分析的参数多达20多项，由以前简单的细胞计数器成为名符其实的血细胞分析仪（hematology analyzer）。,10,近年随着激光技术的应用，令血细胞分析的工作原理从单纯的电阻法得到突破性的进展，出现了能进行多参数相关测量的流式细胞仪，它可测量细胞多项生化成分，如核酸、蛋白质、膜成分、酶活性等等，在基础医学与临床医学上有着广泛的应用。 2、细胞计数器人们研究血细胞的计数问题时，其计数原理曾采用过变阻脉冲法、光电计数法、激光计数法等，,11,现在，因前者简单实用而被普及。仪器测量的细胞数量比手工方法在显微镜下测量的细胞数量要多约100倍，统计误差减少了约90，提高了计数的精确度。 3、变阻脉冲法原理 1变阻脉冲法血细胞计数原理 变阻脉冲法血细胞计数原理简称电阻法原理，是美国科学家库尔特（WHCoulter）1947年首先提出来的，故又称库尔特原理。电阻法计数在大多数细胞计数器中是利用小孔管换能器装置来实现 的，如图1-1所示,12,13,小孔管是在一块2550 m厚的红宝石或蓝宝石上打一小孔，然后将其粘接在一支玻璃管上而制成。小孔直径多为100 m或 75 m，单独用来测试血小板的小孔管，其孔径还要再细些。小孔多位于管底的侧面，所能测试的颗粒大小为小孔直径的240。这样，100m的小孔可以测 240 m大小的颗粒。小孔管内外各置一根铂金电极，两电极间施加一个恒定的电流。当小孔管里加入电解液，并将其置入装有相同电解液的样品杯中时，两电极之间便产生一个恒定的电流。,14,测试时，先将待测血液用洁净的电解液充分稀释，使血细胞在电解液中成为游散状态，然后在小孔管上端加上负压，在负压的抽吸下，混有血细胞的电解液便被均匀地抽进小孔管。血细胞为电的不良导体，当它通过小孔的瞬间，取代了同体积的电解液，从而改变了2个电极之间的电阻，如图12为单个细胞通过小孔时引起电路中电阻变化的情况。,15,16,在电流恒定的情况下，电阻的改变会引起电压的变化。在前一个血细胞通过小孔，下一个血细胞还未靠近小孔时，电极间的电阻又恢复正常。这样血细胞连续地通过小孔，就在电极的两端产生一连串电压脉冲，脉冲的个数与通过的细胞个数相当。体积不同的细胞其电阻率不同，产生脉冲的大小也不同，幅度与细胞体积成正比，如图13给出不同体积细胞通过小孔时产生的电压脉冲。将这些脉冲加以放大、鉴别、整形以后送到计数电路计数，便可计得细胞的个数。,17,18,2血细胞的分别计数原理 细胞的分别计数是指分类计数各种血细胞，血液中各种细胞的体积是不同的，白细胞体积范围在 1201000 m3，红细胞在8595m3，血小板在230m3，血细胞的分别计数便是利用它们的体积及数量的不同。由前述可知，体积不同的红细胞、白细胞、血小板，其产生的脉冲幅度也不同，排列顺序以白细胞最大，红细胞次之，血小板最小。在计数红、白细胞时，可利用一个幅度鉴别电路将血小板筛选掉，这个鉴别电路叫阈值选择电路。如图14所示，阈值电压选择在U1时，只有红、白细胞产生的脉冲参与计数；阈值电压选在U2时，血小板产生的电压脉冲才能参加计数；最下面的小信号为干扰脉冲。,19,20,（1）红细胞计数：正常人体外周血红细胞的数目为白细胞的1000倍左右，当阈值电压选在U1时，白细胞产生的脉冲个数较红细胞产生的脉冲个数少得多，几乎可以完全忽略，红、白细胞数可视为红细胞数。（2）血小板计数：将阈值电压选在U2时，可以去掉干扰计数，并计出红、白细胞和血小板的总数。最后从总数中减去红、白细胞数，即为血小板数。,21,（3）白细胞计数：在计数白细胞时，先在稀释血液中加入一种溶血剂，使红细胞溶解破碎，其碎片体积分散到不影响白细胞计数的程度，红细胞破碎后，将阈值电压选在U1，再对剩下的白细胞产生的脉冲个数进行计数，便可以求得白细胞数。红细胞破碎溶解后，其内部的血红蛋白便释放出来，与溶血剂中的转化剂反应进而转化为颜色稳定的氰化血红蛋白，通过光电比色法可求出血红蛋白的含量。,22,3、细胞直方图与白细胞分类 目前三分类以上细胞计数器均在给出各细胞参数的数据结果时，同时提供3种细胞（红细胞、白细胞和血小板）的细胞体积分布图。并以体积为横坐标，以细胞的相对数量为纵坐标，把细胞在一个个很小的体积范围（又称通道、频道）内的数量分布情况表达出来，我们称之为直方图（histogram）。通过细胞直方图我们可形象直观地获得细胞体积分布的特征，另外白细胞直方图尚可用于白细胞亚群的分类。 直方图是由测量通过感应区的每个细胞脉冲积累得到的，在计数的同时进行分析测量，如图15为典型红、白细胞及血小板直方图。,23,24,25,26,直方图的X轴以fl为体积单位，其数值设定与该细胞的大小有关，以血小板的设定最小，白细胞最大。Y轴以细胞相对数量为单位，当细胞数量过少而引起直方图曲线偏低时，计数器会自动在Y轴方向按比例放大、抬高曲线。（1）红细胞直方图：红细胞直方图如图 15 a，体积分布曲线的显示范围从24360 fl，计数器把大于36 fl的颗粒计数为红细胞，可得到2个细胞群体：红细胞主群，从50 fl偏上开始有一个呈正态分布曲线，又称“主峰”；小细胞群，位主群右侧，又称“足趾部”，是一些多聚体细胞、白细胞、小孔残留物等。,27,（2）血小板直方图：血小板直方图如图15b，典型血小板直方图呈对数正态分布，显示范围036 fl，计数范围为220 fl（3）白细胞直方图与白细胞分类：如图 15 C，白细胞体积分布曲线的显示范围是30450 fl。如前述，白细胞计数时先加溶血剂将红细胞溶解后再计数，溶血剂不仅破坏红细胞，还作用于白细胞，使其膜表面产生小孔，致细胞失水皱缩，此时细胞大小实际上是细胞核与胞浆中颗粒成分之和。经过溶血剂的化学处理，各群白细胞体积有所改变,28,，大小大致为：淋巴细胞单核细胞粒细胞。在直方图上表现为3个白细胞亚群：3590 fl范围的淋巴细胞群（LY），可以包括淋巴细胞；91160 fl范围的单核细胞群（MO），可以包括单核细胞、幼稚细胞；161450 fl范围的粒细胞群（GR），可以包括嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、中性粒细胞。计数器根据3个体积范围内的颗粒数与总颗粒数之比例，便可计算出白细胞三分类，即： LY（）=（3590 fl范围的颗粒数）（3450 fl范围的颗粒数）， MO（）=（91160 fl范围的颗粒数）（3450 fl范围的颗粒数）， GR（）=（161450fl范围的颗粒数）（3450 fl范围的颗粒数），,29,这种分类方法叫直方图分类法。计数器直方图分类与人工染色显微镜分类比较，相关系数为：LY0.9，MO= 0.7，GR0.9，正常细胞分类的可信度达 95，不需人工复查。白细胞直方图除显示分类外，还显示4个报警区域，如果某个报警区域里的计数值异常增多，就在此区域出现“R”报警：R1为直方图上淋巴峰左侧区域有异常，可能有血小板凝块、巨大血小板、有核红细胞、不溶性红细胞和冷凝集素等因素的影响；R2为直方图上淋巴峰和单核峰之间的区域有异常，可能有异型淋巴细胞、幼稚淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性细胞或嗜碱性细胞等因素的影响；,30,R3为直方图上单核峰和中性粒峰之间的区域有异常，可能有不成熟粒细胞、嗜酸性细胞等因素的影响；R4为直方图上中性粒峰右侧区域有异常，粒细胞数量过多；RM为以上区域2个或2个以上同时有异常。 分类报警的实验前因素有：试剂污染、试剂不配套、样品没有混匀、血样存放时间太长和电噪声等。 4、定量原理 定量装置是为了对一定容积的血细胞进行计数而设计的，可确保被计量样品液容积的精度。,31,4、定量原理 定量装置是为了对一定容积的血细胞进行计数而设计的，可确保被计量样品液容积的精度。 （1）定量装置分类：定量装置可分为有水银压力计式和无水银的光电检测式2种。前者系早期产品，由于水银的挥发性和毒性，使用不当易造成污染和公害。80年代后逐渐采用光电检测式定量装置。 光电检测式定量装置常用的有多种形式，图16是其中的一种,32,33,计数时，样品液在负压吸引下通过小孔进入小孔管。当液面沿管路上升到P3点时，弯曲的液面使发光管发出的光线折射，电检测器便产生一个脉冲信号去控制电路令计数开始；当液面上升到P1点时，又产生一个脉冲信号令计数停止。P1和P3之间的容量便等于进入小孔管被计数的样品液容量。（2）定量装置中的特殊部件：定量装置中的特殊部件主要有负压泵、压力调节器和废液瓶。,