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,第四章 病 毒,本章内容,第一节 概述 第二节 病毒的形态结构与化学组成 第三节 噬菌体 第四节 真核细胞病毒 第五节 亚病毒 第六节 病毒与发酵工业,第一节 概述,一、病毒的发现和研究历史 二、病毒的定义与特点 三、病毒的分类 四、病毒的培养与纯化,病毒和我们的关系,“Virus”,它是由拉丁文中“virus”一词演化而来,即“有毒的物质”,第一节 概 述,一、病毒的发现和研究历史,1886年,A. Mayer 发现具有传染性的烟草花叶病;,1892年,D. Ivanovsky烟草花叶病病原体能通过细菌滤器:一种能通过细菌滤器的“细菌毒素”或“极小细菌”,1898年,M W Beijerinck对烟草花叶病病原体的研究结果:,能通过细菌滤器;可被乙醇沉淀而不失去其感染性,能在琼脂凝胶中扩散;用培养细菌的方法不能被培养出来,推测只能在植物活细胞中生活,比细菌小的具有传染性的活的流质 (contagium vivum fluidum),1884年Chamberland发明细菌滤器,1900年前后,包括口蹄疫(foot and mouth disease)在内的多种动植物疾病病原体的滤过性特性被证明。,F W Twort(1915年)、F dHerelle(1917年),分别发现 细菌(Shigella dysenteriae)病毒-噬菌体,1935年,W M Stanley首次提纯并结晶了烟草花叶病毒;Bawden等证明烟草花叶病毒的本质为核蛋白; 1940年,Kausche首先用电镜观察到烟草花叶病毒颗粒.,1952年,Hershey和Chase利用同位素证实噬菌体的遗传物质是DNA,将人类带入病毒的分子生物学阶段。,极大地丰富了现代生物学(微生物学、分子生物学、分子遗传学)的理论与技术;,病毒学(virulogy) :,研究病毒(virus)的本质及其与宿主的相互作用的科学,是微生物学的重要分支学科。,有效地控制和消灭人及有益生物的病毒病害; 利用病毒对有害生物、特别是害虫进行生物防治; 发展以基因工程为中心的生物高新技术产业;,非细胞生物,至少含核酸和蛋白质二种组分,亚病毒,真病毒,类病毒,拟病毒,朊病毒,只含有不具侵染性的RNA组分,只含蛋白质组分,只含具侵染性的RNA组分,本章主要介绍真病毒,二、病毒的定义与特点,病毒:是一种结构简单,能够自我复制并具有侵染性的独特非细胞生物体。现代病毒学家把病毒这类非细胞生物分成真病毒(Euvirus,简称病毒)和亚病毒(Subvirus)两大类:,病毒是一类既具有化学大分子属性,又具有生物体基本特征;既具有细胞外的感染性颗粒形式,又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。,病毒分两个阶段(以两种形式)存在:胞外阶段:“毒粒”形式存在,可抵抗几乎所有酶的侵袭,但不能独立于活细胞增殖; 胞内阶段:主要以正在复制的核酸形式存在,诱导宿主细胞合成病毒组分;,毒粒:完整的病毒粒子(virion),由蛋白外壳包裹一个或多个DNA或RNA分子构成,特性,1)个体微小,在电子显微镜下才能看见;,2)不具有细胞结构,其主要成分为核酸和蛋白质,故称为“分子生物”;,3)一种病毒只含有DNA或RNA一种类型的核酸;,4)绝对的细胞内寄生,在细胞外不能增殖:既无产能酶系,也无蛋白质和核酸合成酶系,只能利用宿主活细胞内现成的代谢系统合成自身的核酸和蛋白质;,5)没有个体生长,不能进行细胞分裂,以核酸复制和蛋白质合成、然后装配的过程实现其大量繁殖;,7)对大多数抗生素不敏感,对干扰素敏感。,6)在离体条件下,以无生命的生物大分子状态存在,并保持其侵染性;,三、病毒的分类,病毒几乎可以感染所有的细胞生物,并具有宿主特异性。,人们习惯根据其宿主种类将病毒分类:,噬菌体(phage),真菌病毒(fungi viruses),植物病毒(plant viruses),动物病毒(animal viruses),国际病毒分类委员会(International Committee for Taxonomy of Viruses,ICTV)提出了分类依据和建立了分类系统。,分类依据,核酸的特征、壳体的对称形式、有无包膜、宿主的种类、引起的疾病种类、复制和释放方式等。,命名规则,1996年国际病毒分类委员会提出38条新的病毒命名规则,病毒分类系统依次用目、科、属、种分类等级。,1)噬菌体的培养,1、病毒的培养,(二元培养物法),四、病毒的培养和纯化,噬菌斑(plaque):,将少量噬菌体与大量宿主细胞混合后,在合适条件下培养一定时间后,在平板表面布满宿主细胞的菌苔上,出现一个个肉眼可见的透明小圆斑。( “负菌落” ),设0.10mL稀释度为10-6的病毒悬液可产生75个噬菌斑,则样品的噬菌斑形成单位为: PFU/mL=(75 PFU /0.10 mL )(106)=7.5 108,2)动物病毒的培养,动物病毒,实验动物,鸡胚,多种细胞培养,在尿囊膜上形成一些白色的庖痘(感染造成局部组织病损),感染,若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理,病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区域,即蚀斑(plaque)或称空斑。,包涵体(inclusion body):,在某些感染病毒的宿主细胞质或细胞核内,出现光学显微镜下可见的大小、形状和数量不等的小体。,多数位于细胞质内,如:痘病毒、狂犬病毒 少数位于细胞核内,如:疱疹病毒和腮腺炎病毒 有的既可在细胞质内,又可在细胞核内,如:麻疹病毒,包涵体可以是病毒粒子的聚集体,如昆虫核型多角体病毒和质型多角体病毒的包含体;也可以是病毒结构蛋白与感染有关蛋白质等病毒组分的聚集体,多角体:,核型多角体病毒(NPV):是我国自主研究并应用于农业实践的第一个病毒杀虫剂。,昆虫细胞内形成多角形包涵体,可作为病毒杀虫剂。,植物病毒,敏感植物叶片,被感染部位的细胞快速死亡而形成局部坏死斑,或称枯斑,即便没出现坏死斑,被感染的植物仍会表现一定的病症,如色素形成和叶子形状改变等。,3)植物病毒的培养,(盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等),2、 病毒纯化,标准:纯化的病毒制备物应保持其感染性,纯化的病毒制备物的理化性质应具有均一性,方法:主要化学组成为蛋白质,采用蛋白质提纯方法,具有一定的大小、形状和密度,采用离心,差速离心、梯度离心(超速离心),一、病毒的形态结构,1、病毒的形状和大小,个体小(测量单位nm),必需在电镜下观察;不同病毒的毒粒大小差别很大(10400nm),(1)大小,痘病毒: 300450nm 170260nm(最大) 双粒病毒:直径 1820nm (最小),第二节 病毒的形态结构与化学组成,(2)病毒的形态,弹状(狂犬病毒)、砖块状(痘病毒)、 丝状(大肠杆菌f1、fd、M13噬菌体)等,多形性(流感病毒,新分离的毒株呈丝状,在细胞内稳定传代后转变为拟球状)。,基本形态:,球形或拟球形(大多数动物病毒);,杆状(植物病毒和昆虫病毒);,蝌蚪状(大肠杆菌T偶数噬菌体),其他形态:,各种毒粒的大小、形态差异很大,蝌蚪状(大肠杆菌T偶数噬菌体),砖块状(痘病毒),丝状(大肠杆菌M13),球状(脊髓灰质炎病毒),衣原体,大肠杆菌,红细胞,杆状(TMV),基本构造:核衣壳(nucleocapsid),非基本构造,2. 病毒的基本结构,核心(core):DNA或RNA,衣壳(capsid):蛋白质,包膜(envelope) :脂蛋白或类脂、糖蛋白,刺突(spike):糖蛋白,核心,衣壳,包膜,刺突,衣壳粒(capsomere或capsomer):是组成衣壳的蛋白质亚单位,3.几种典型病毒衣壳的结构,螺旋对称衣壳病毒:烟草花叶病毒,病毒可以根据衣壳中衣壳粒的排列方式将其分为3种:,二十面体对称衣壳病毒:腺病毒,复合对称衣壳病毒:T4噬菌体,壳体外形如中空的蛋白质圆管,呈坚硬或柔韧状。由2130个相同的蛋白质亚基(158个氨基酸)以逆时针方向螺旋状排列,形成一个长300nm,内径4nm,外径15nm的刚直中空柱。ssRNA盘绕在壳体内面由亚基形成的沟内,与蛋白质亚基通过弱键结合。,螺旋对称壳体病毒,代表:TMV,并非所有螺旋对称衣壳都像TMV衣壳一样是刚直的,流感病毒的RNA就包围在薄的、柔软易弯曲的螺旋壳体内,其衣壳折叠在一起,外有包膜。,流感病毒,二十面体对称壳体病毒,衣壳有20个等边三角形面,12个顶角。包括12个五邻体(分布在12个顶角上的衣壳粒)和240个六邻体(分布在棱上和面上的非顶角衣壳粒)。核心为线状双链DNA(dsDNA),核酸分子以高度卷曲的状态存在于衣壳内。,代表:腺病毒,五邻体,六邻体,二十面体衣壳在形成时通常是由五边形衣壳粒(五邻体)和六边形衣壳粒(六邻体)组成的,(参见P74),其壳体由头部和尾部组成。通常头部呈二十面体对称,尾部呈螺旋对称。线状dsDNA折叠盘绕于头部的核心。,复合对称衣壳病毒,代表:大肠杆菌的T偶数噬菌体,头,尾髓,颈环,尾鞘,尾丝,刺突,基板,1、 病毒的核酸,病毒基因组大小差别很大最小的基因组(MS2病毒,QB病毒)只有1 106 ,仅够编码34种蛋白质,这些病毒利用重叠基因来节省空间。最大的基因组(T偶数噬菌体,疱疹病毒,痘病毒)达1.6 108 ,可编码100多种蛋白质。,二、病毒的化学组成,单链DNA(ss DNA); 双链DNA(ds DNA); 单链RNA(ss RNA); 双链RNA(ds RNA),4种类型,动物病毒这4种类型都有;植物病毒通常含有ssRNA;噬菌体通常为ds DNA,但也有一些噬菌体为ss DNA或ss RNA。,(1) DNA病毒,dsDNA:大多数DNA病毒以dsDNA作为遗传物质。许多病毒dsDNA经过修饰,呈线性,少数为环状dsDNA。,特殊的碱基:除常见核苷酸外,许多病毒具有特殊的碱基,如,大肠杆菌T偶数噬菌体以5-羟甲基胞嘧啶代替胞嘧啶。,噬菌体的线性dsDNA: 有由12个碱基组成的粘性末端,粘性末端配对可使DNA环化。,ssDNA: 少数,如X174、M13噬菌体等,有线性和单链闭合环状DNA两种。,(2) RNA病毒,多数RNA病毒以ssRNA作为它们的遗传物质。正链或阳性链:RNA碱基序列与病毒mRNA相同,指导蛋白质合成。如:脊髓灰质炎病毒等。负链或阴性链:病毒RNA基因组与病毒mRNA互补。如:狂犬病毒等。,片段基因组:许多RNA病毒基因组被分为独立的片断,每个片段编码一种蛋白。有的病毒基因组可以分为10到12个片段(如呼肠病毒),通常所有的片段都包含在同一个衣壳中。不过,也有些病毒将片段基因分布在不同的病毒粒子中(如:雀麦花叶病毒),但它们能够成功地侵染同一宿主。,许多植物及动物病毒的正链RNA基因组5端具有7-甲基鸟嘌呤核苷帽子结构,3末端具有poly-A尾巴。,一少部分病毒具有dsRNA基因组,都是片段式的。,2、病毒的蛋白质,衣壳蛋白:占病毒蛋白质成分的绝大部分。保护核酸;当病毒无包膜结构时,衣壳参与病毒对宿主的吸附、侵染;决定病毒对宿主的专一性和病毒的抗原性。,包膜蛋白:包膜的脂质和糖类是正常的宿主组成成分,但蛋白是由病毒基因编码形成的,可伸出包膜形成刺突 。,存在于病毒中的酶类:病毒酶位于衣壳内,其中许多酶参与核酸的复制,例如,逆转录酶。也有些病毒的酶位于包膜或衣壳上(例如,流感唾液酸苷酶),协助病毒的侵染。,3、病毒的其它化学成分,包膜中含有丰富的磷脂和胆固醇、糖类 ,来源于宿主细胞 ;,少数无包膜的病毒也存在脂类;,一些病毒粒子中存在有机阳离子(如丁二胺、精胺)和无机阳离子。,第三节 噬菌体,一、噬菌体的分类,多数噬菌体可以按照其形态分为以下四类:无尾二十面体型收缩尾型(结构最复杂,例如E. coli的T偶数噬菌体)非收缩尾型丝状噬菌体,噬菌体分类的依据:宿主种类、免疫学关系等。 但目前最主要的分类依据还是噬菌体的形态和核酸特性。,
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