褐变反应及在荔枝保鲜加 工中的表现,一、本科知识复习,褐变反应 酶促褐变非酶促褐变 美拉德反应 焦糖化反应 维生素C氧化,美拉德反应,(1) 定义胺、氨基酸、蛋白质与糖、醛、酮之间的这类反应统称为美拉德反应。,美拉德反应的机理,大体上分为 初始阶段 中期阶段 未期阶段,HC=OHCOHOHCHHCOHHCOH CH2OH,+ RNH2,HC=NRHCOHOHCHHCOHHCOH CH2OH,HC- NHRHCOHOHCH OHCOHHCCH2OH,- H2O,薛夫碱 (schiff),环化葡基胺,A、初始阶段, 羰氨缩合 环化为N-葡萄糖基胺,在稀酸条件下羰氨缩合产物易水解 亚硫酸根可与醛形成加成化合物， 阻止葡糖胺形成。,C、未期阶段,（参加的底物包括上几步所产生的所有醇、醛、糠醛、二羰基化合物、还原酮类等）,NHRO,CHO O CH2OH,CH3OO,CH3OCOHCOH,氨基醛 氨基酮 二乙酰乙酸 乙醛 丙酮醛 二氧化碳 氨基等,黑色素,酶促褐变 Enzymic Browning,1定义和意义酶促褐变当果蔬受到损伤时，组织和氧接触，由酶催化造成变色的作用。意义: 利:不利:,茶叶、可可豆,影响食品色泽和风味。,2. 机理,什么酶？ 什么底物？ 什么产物？ 此酶的特性？ 反应机理小结：,多酚氧化酶,酚类物质,氧化成醌再聚合成褐色物。,需氧，高热酸性可抑活。,酶促反应过程,简单来说就是 催化酚类物质形成醌及其聚合物的结果。酚类化合物 醌类化合物 聚合作用（酚酶、氧） 黑色素,多酚氧化酶,二、荔枝 在保鲜和加工中的颜色变化及其机理,近年广东省荔枝种植面积已达540万亩，产量90多万吨占全国的2/3。由于荔枝产量剧增，鲜销饱和而加工相对滞后，荔枝加工的需求空前迫切。在荔枝贮藏加工过程中，果皮褐变是最突出的问题，荔枝果皮褐变之快，在其他,开篇语,水果之中极为罕见。常温下，荔枝采后24 h内开始褐变。,国内外对此进行了大量研究，主要的内容包括荔枝果皮褐变机理与防褐技术。荔枝果皮褐变是多个反应的综合结果。引起果皮褐变的因素也是多个。由此得研究出了多个控制荔枝果皮褐变的措施。,荔枝果皮褐变现象及相应的成分变化,1. 酶促褐变与荔枝褐变,1.1 实验一 酸处理对采后荔枝果皮色泽与生理活性的影响 1.2 实验二 低温处理对荔枝果皮色泽的影响 1.3 PPO特性 1.4 酶促褐变实验讨论,一、酸处理对果色的影响（冷藏条件） 果皮色度的测定 采用色差计测定果皮的颜色。,记录 L、a、b 值表示果实颜色，其中 L表示亮度，范围从黑 0 到白 100；a值的正值表示色泽红 / 紫，负值表示浅蓝/ 绿；b 的正值表示黄，负值表示蓝。c值表示色度，=SQRT（a2b2）。,1.1实验一, 对a值的影响,（a 值越大代表颜色越鲜红） 随贮藏时间延长，果实的a值下降，果皮褪色。 4%酸处理 果实红色立即变得更鲜艳，a值增大。35d 时a值比对照高45.2。说明4酸处理延缓了果皮褪色速度。 2酸处理 14d时， a 值明显低于对照( p 0.05)，果皮开始褪色， 35d时 a值进一步下降，果皮已经完全变褐，说明酸处理不够，会加速果实褐变。,荔枝经4 酸处理后可使代表果皮亮度的L 值立即增大4.48。在冷藏过程中，对照果实的L值呈明显下降趋势，而酸处理可使果实L 值维持在较高水平上。 4 酸处理使果皮的色度值C 显著增大。在冷藏过程中，对照果实与2 处理果实的C值持续下降，果皮呈现褐色，而 4 酸处理的果实在35d 时c 值比对照高56.3。, 对L、C值的影响,二、酸处理对果皮 pH 值的影响,新鲜果皮的pH 为4.45，随着浸酸（浓度为4）时间延长，果皮 pH值不断降低。4 酸处理2min 时，果皮的pH 值下降到 2.97。 在 0下冷藏过程中，果实的 pH值逐渐升高，35d 时果皮pH 值升高到 3.26。对照果皮pH 值28d时增加到的4.80。,酸处理明显抑制了荔枝果实 PPO 酶活性。2 与 酸处理果实的酶活性分别是对照的47 和 2；4 酸浸果后再用清水漂洗，果实的酶活性也只有 17。在冷藏过程中，随着时间的延长，对照果实PPO 活性逐步升高，果皮逐渐褐变；但,三、酸处理对荔枝果皮有关酶活性的影响,酸处理的果实PPO 酶活性一直处于较低水平，4 酸处理果实在 14、35 时分别只有对照的 49、18。,果实只有对照的 1/3左右。4HCL 处理后清水冲洗的果实POD活性在第14 时较高，是对照的 88。,酸处理也抑制荔枝果皮的 POD 活性。2 酸、4 酸、4 酸 WD 处理使果实POD酶活性分别下降了 29、71、72。冷藏过程中酸处理果实的POD 酶活性始终低于对照，特别是在第35，酸处理的,四、pH影响讨论,采收时，荔枝果皮pH 一般在35 之间，贮藏过程中，果皮 pH 值逐渐升高至57。酶促褐变环境由不合适变为合适。 PPO的最适反应pH 为 6.8；POD 最适反应pH 约为 6.5。当酸处理降低荔枝果皮 pH 值时，PPO、POD 酶活性立即被明显抑制。 在果实冷藏过程中，这 2 种酶的活性仍然处于较低水平。PPO与褐变程度的高度相关性说明荔枝存在酶促褐变。,荔枝果皮之中存在过氧化物酶POD，它是否也参与了催化褐变的反应，有待于进一步考察。有人认为POD活性变化可能是褐变的早期标志，可能参与催化酚类物质的氧化，使果皮褐变。同时催化谷胱甘肽、 抗坏血酸的氧化，减少了内源的活性氧化清除剂。,从PPO酶活性看,低温下酶活性下降,但出库后PPO活性比出库前有所上升,所以说明酶活性与温度有关,低温能抑制酶活性。,1.2实验二,霜疫霉病，-1处理的果实仍然保持红色，没有病害发生。 在低温条件下PPO与褐变的相关性说明荔枝果皮褐变与酶促褐变相关。,不同荔枝品种果实的结冰点不同，变化范围为-2.14-2.87。3下贮藏 35 d时，75.0%的果实出现褐斑，8.3%的果实发生,1.3 PPO特性： 3-甲基儿茶酚为最佳底物。,米氏方程曲线,由图中直线斜率纵轴截距可求出 Km=2.209x10-2mol/L,1.4 酶促褐变实验讨论,两个实验都表明，PPO活性与果皮褐变程度成正相关关系，说明荔枝褐变存在酶促褐变。但酶促褐变观点仍然不能很好地解释以下问题： 如通过柱层析从荔枝果皮中分离出6 种含酚羟基的物质，只有1 种可被PPO 催化氧化。 荔枝果皮大量存在的红色色素即花色素苷,虽然是酚类物质，但不能直接被荔枝果皮的PPO 所催化氧化。,2 花色素苷的降解和变色 花色素苷在贮藏过程中可能降解及变色。 花色素苷是一类水溶性酚类植物色素，存在于细胞液泡中，荔枝果皮的花色素苷主要是矢车菊素 芸香二糖苷，有一个特征性很强的三环结构，环上有一个或多个酚羟基，影响花色素苷降解及变色的主要因素有温度、pH值、氧化还原物、金属离子、辅色素、酶等。,2.1 花色素苷的降解,实验一 荔枝褐变过程中花色素苷含量与褐变指数的相关性 实验二 荔枝果皮花色素苷酶的存在 实验三 酸处理对花色素苷及其酶的影响 实验四 温度处理对花色素苷及其酶的影响 实验五 氧化还原物质对荔枝果皮花色素苷稳定性的影响,2.2 花色素苷的变色,实验六 酸处理对采后荔枝果皮色泽与生理活性的影响,2.1实验一 荔枝褐变过程中花色素苷含量与褐变指数的相关性,褐变指数和花色素苷呈显著负相关性。可见花色素苷的降解参与了荔枝的褐变过程。,2.1实验二 荔枝果皮花色素苷酶的存在,荔枝果皮存在高活性的花色素苷酶，而在其它同样富含花色素苷的水果中，如红苹果、红葡萄、草莓和杨莓等则不能检测到花色素苷酶活性 。耐藏的不易褐变的荔枝品种如桂味、兰竹等含有较低活性的花色素苷酶，而易于褐变的荔枝品种如糯米糍等则含有较高活性的花色素苷酶。,荔枝采后花色素苷酶活性变化,在荔枝采后果皮褐变过程中，荔枝果皮花色素苷酶活性一直维持在较高水平，并随着褐变指数的升高有上升的趋势。 现推测,花色素苷的糖组分可成为PPO与花色素苷结合的立体障碍，使得PPO,对花色素苷不起作用。荔枝果皮内存在的水解花色素苷糖苷键的系统，当花色素苷的糖组分去掉以后,剩下的花色素部分对PPO、 POD 的亲和力大大提高。导致褐变的发生。,4%HCl处理明显抑制了冷藏果实花色素苷酶活性，14d时酶活性只有对照的36%，但2%HCl处理使果实的酶活性在14d时维持较高的水平，导致果皮迅速退色、褐变。,2.1实验三 酸处理对花色素苷及其酶的影响,不同pH对花色素苷保存率的影响,pH1.47缓冲溶液下降解最慢，颜色能长期保持红色。随pH升高花色素降解加快，在pH7.01时迅速降解，11天后含量降解为0。,温度对花色素苷的降解作用也很显著，在25 -30下，花色素苷能够很快降解(半衰期12. 1天)，随着温度的进一步升高，花色素苷的半衰期也大幅下降，到60时，半衰期降至,0.42天，这与采摘前后环境的温度也基本吻合。低温能够很好的抑制花色素苷的降解，但试验证明-7 -9的低温会使花色素苷在24 h内发生不可逆降解。,2.1实验四 温度处理对花色素苷及其酶的影响,氧化剂可显著地促进荔枝果皮花色素苷的降解，当pH值升高时，这种作用更为明显，还原剂不能抵消氧化剂的破坏作用，反而促进花色素苷的降解。试验表明，Na2S207可提高花色素苷的稳定性，形成花色素苷的S032的复合物。,AsA抗坏血酸；DTT二硫苏糖醇；Cys半胱氨酸,2.1实验五,酸溶液处理荔枝果实，可使果皮的pH值立即降低，果实呈现鲜艳的红色，但花色素苷含量并不增加。因此，认为荔枝果皮颜色变化主要依赖于pH值，而与花色素苷含量无关。,2.2实验六,在溶液介质中，花色苷会随pH有几种结构的变换。对于一个给定的pH值，在花色苷的4种结构之间存在着平衡：蓝色的醌式（脱水）碱(A)、红色的花钅羊正离子(AH+)、无色的甲醇假碱（B）和查尔酮（C）（图3）。 花色苷在pH值很低时，其溶液呈现最强的红色。随着pH值的增大，花色苷的颜,色将褪至无色，最后在高pH值时变成紫色或蓝色。但是，具有两个或两个以上酰基的花色苷在整个pH范围内都表现出了相当好的颜色稳定性。另外，酰化部分的性质对花色苷的稳定性也有影响,在pH值为4.69时向缓冲液中加入酸液，花色素苷能恢复红色，但更高的pH值(7.01)下，不能恢复。保持花色素苷最稳定的pH值在3.5左右。花色素苷在pH1.03.0 下呈深红色， pH5.0下几乎褪为无色，加酸可恢复红色，其颜色变化依赖于介质的pH值。,3.失水对荔枝褐变的影响荔枝果实采后常温无包装贮放12- 24h即出现褐变症状。一方面，由于荔枝果皮与果肉在结构上完全分离，两者之间无输导组织相连，当果皮失水后，果肉中的水分未能给予有效补充，当果皮失水率达到果皮含水量的50%左右时即出现褐变症状，,另一方面，荔枝果皮结构角质层较薄，海绵组织疏松，外果皮和中果皮之间的细胞含有褐变物质，容易失水诱发褐变。陈文军等用电镜观察也证实，荔枝果皮失水时，果皮褐变首先从果皮龟裂片突起部位开始，然后随着褐变程度增加，栅状组织细胞萎缩，细胞相互挤压变形破裂。褐变严重时，细胞超微结构完全破坏。,综上所述，荔枝果皮褐变是一个复杂的过程，在此过程中，存在花色素苷降解变色和酶促两个过程。在荔枝贮藏过程中，由于果皮的脱水作用使pH值上升，导致花色素苷变色或降解，前者是可逆的，在酸作用下可恢复红色，而降解作用是不可逆的，降解的产物可能被PPO进一步催化氧化。由于荔枝果皮中同时存在着较多的酚类物质，这些物质也直接或间接的参加了褐变反应，尤其是在荔枝贮藏的后期，主要以酶促褐变为主。POD也参加了此过程；荔枝皮的失水是重要褐变诱因；果实中乙烯含量的提高也是褐变的诱导因素。,