第三章 核酸结构与功能,第六节 核酸酶,第一节 核酸的化学组成,第二节 核酸的一级结构,第三节 DNA的空间结构与功能,第五节 核酸的理化性质及应用,第四节 RNA的空间结构与功能,一、核酸,1868年，Friederich Miesescher 从脓细胞核中分离出一碱性蛋白和含磷的有机酸的混合物，称之为核素 1928-1952年，证实遗传的物质基础是核酸 核酸（nucleic acid)是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子,第一节 核酸的化学组成,核 酸 分 类,核酸,核糖核酸（ribonucliec acid, RNA)：细胞质和细胞核内，参与细胞内DNA遗传信息的表达,脱氧核糖核酸(deoxyribonucliec acid,DNA) ：细胞核和线粒体内，携带和传递遗传信息，决定细胞和个体的基因型（genetype),病毒中，RNA也可作为遗传信息的载体,两类核酸的基本化学组成比较,DNA RNA嘌呤碱 腺嘌呤 (A) 腺嘌呤(A)（Purine bases ） 鸟嘌呤 (G) 鸟嘌呤(G)碱基Base 嘧啶碱 胞嘧啶 (C) 胞嘧啶(C)（Pyrimidine bases） 胸腺嘧啶(T) 尿嘧啶(U) 戊糖(Pentose) D-2-脱氧核糖 D-核糖酸(Acid) 磷酸 磷酸,用酸将DNA/RNA完全水解 DNA：含氮碱基、2-脱氧-D-核糖和磷酸 RNA：含氮碱基、D-核糖和磷酸,磷酸(phosphate),戊糖 (pentose),碱基 (base),一、含氮碱基 (包括：嘌呤和嘧啶),C,N,C,C,C,N,N,N,C,H,H,H,NH2,嘌呤碱基,1,2,3,4,5,6,7,8,9,嘌 呤,NH2,O,H2N,腺嘌呤A,鸟嘌呤G,6,2,6,H C,HN,HC,CH,CH,N,NH2,O,O,O,O,O,CH3,嘧 啶,胞嘧啶C,尿嘧啶U,胸腺嘧啶T,1,2,3,4,5,6,二、戊糖（DNA含脱氧核糖；RNA以核糖取代了脱氧核糖）,三、核苷（嘌呤或嘧啶与糖相连后形成）,四、核苷酸 (核苷的磷酸酯，磷酸位于C5),AMP,ADP,ATP,腺苷酸及其多磷酸化合物,第二节 DNA的结构与功能,一、DNA的一级结构DNA的一级结构是指核酸分子中核苷酸排列顺序及连接方式 * 3,5磷酸二酯键,前一个脱氧核苷酸的3-OH和后一个的5-磷酸缩合形成磷酸二酯键 * 方向性：通常规定53为正向,DNA一级结构的表示法,二、DNA的二级结构,1953 年Watson 和 Crick 提出右手双螺旋模型 Chargaff法则：* A=T，GC；* 不同物种的DNA碱基组成不同；* 同一个体的不同器官以及不同脏器的DNA具有相同的碱基组成,DNA分子由两条反向的平行多核苷酸链围绕同一中心轴构成的双螺旋结构。双螺旋表面形成大沟和小沟 双螺旋直径2nm，碱基平面垂直于螺旋纵轴,右手双螺旋模型要点,两条链都由磷酸和脱氧核糖以3，5-磷酸二酯键相连而成，它们位于螺旋的外侧。嘌呤碱基与嘧啶碱基位于螺旋的内侧，糖基平面与碱基平面相垂直 两条多核苷酸链依照碱基互补配对的原则形成的氢键相连接；A-T间形成两个氢键；G-C间形成三个氢键,碱基配对示意图,二、DNA结构的多样性,A-DNA：右手螺旋,B-DNA：Watson-Crick模型，右手螺旋生理条件下DNA最稳定的结构形式,Z-DNA：左手螺旋,三、 DNA的三级结构,DNA的三级结构：DNA双螺旋结构进一步盘曲形成的复杂结构。以超螺旋最为常见,负超螺旋模型（多见）,正超螺旋,真核生物的三级结构常是以核小体的形式存在，核小体常由约200个碱基对的DNA和包括H1, H2A，H2B，H3，H4在内的5种组蛋白结合在一起所构成,核小体 的核心,长约140bp的DNA分子绕核心部位1圈,四、真核生物基因组,基因：细胞遗传信息的携带者，是DNA或RNA的功能性片段。它是多核苷酸链中能够决定一种蛋白质或一条多肽链的遗传单位 基因组：生物体内遗传信息的组合。对于高等生物来说，一套染色体构成一个基因组,第三节、RNA的结构与功能,RNA的结构特征：1. RNA分子的碱基组成主要是A、G、C、U。此外，RNA分子中含有多种稀有碱基 2. RNA多为单股多核苷酸链，局部可形成双链 3. RNA分子比DNA分子小。按其在基因表达中的作用常分为三大类,一、转移RNA,转移RNA（transfer RNA，tRNA）：在多肽链的合成中起转运氨基酸的作用 特征：1.分子量小，常由70-90个核糖核苷酸残基组成，约占总RNA的10-15 2.稀有碱基及核苷含量丰富 3.tRNA的5端大多为pG，3端为CCA（与氨基酸相连） 4.tRNA均可以形成二级和三级结构,tRNA的二级结构呈三叶草型，二级结构有四个螺旋区、 三个环、 和一个附加叉 第一个环: DHU环，含二氢尿嘧啶 第二个环: 反密码环，与mRNA上的三联密码互补配对，在蛋白质合成中解读密码子，把正确的氨基酸引入合成位点第三个环:T环，含有稀有碱基胸腺核苷T和假尿苷 tRNA的三级结构为倒L型,tRNA二级结构示意图,tRNA三级结构示意图,二、信使RNA(mRNA),信使mRNA是蛋白合成的模板。mRNA种类多，含量少，占RNA总量的5-10。mRNA的T1/2短，一般不超过数小时或几天。代谢率高。组成单位：A、G、C、U 它们按一定顺序通过3，5磷酸二酯键相连形成一多核苷酸链。其残基数从几百到几万不等,真核生物mRNA的一级结构特点,mRNA的3端有一长约200个A的polyA尾 mRNA的5端有一7mG.5ppp5NpN帽 真核细胞mRNA的二级结构没有发现有规律可循，但mRNA自身可以在局部折叠形成局部性双螺旋或发卡结构 真核细胞核内的mRNA的初级转录本含有内含子，再变为成熟的mRNA之前尚需一系列的剪切加工,mRNA结构示意图,三、核蛋白体RNA,核蛋白体RNA（ribosomal RNA ，rRNA）与蛋白质组成核蛋白体参与蛋白的合成，是蛋白合成的场所。rRNA是细胞中RNA含量最多的一种，约占总RNA的75-80 真核细胞中含4种rRNA，按其含氨基酸残基数目的多少，分为28S、5.8S（大亚基）；18S 、 5S（小亚基）,一、 rRNA的结构特点,1. 含量最丰富,约占总RNA的80%以上,2. 与核蛋白体蛋白结合成核蛋白体, rRNA与蛋白质既可分离,又可结合,3. 核蛋白体由大小两个亚基构成,两亚基呈不 规则形状,聚合时中间有裂缝,可通过mRNA,二、rRNA的功能,是细胞内蛋白质合成的场所,其他小分子RNA,小核RNA（SnRNA)、,小核仁RNA(SnoRNA)、,小胞质RNA（scRNA/7SL-RNA),功能：参与HnRNA和rRNA的转运和加工,原核生物核糖体的亚基组成,原核生物核蛋白体,真核生物核蛋白体,核酶1981年， T. cech 从四膜虫中发现：一类具有自身催化，并可以剪切去除RNA内含子的催化活性的RNA分子，称之为核酶 从此改变了“酶的化学本质为蛋白”的传统概念,第四节 核酸的理化性质,一、核酸的一般性质核酸是生物大分子，具有大分子的一般性质。表示核酸分子的大小的方式除了分子量外，常用碱基数目或碱基对数目来表示。核酸是两性电解质，但因磷酸基酸性较强，常显酸性,二、核酸的紫外吸收特性,嘌呤碱和嘧啶碱有共轭双键，都能强烈吸收紫外光，最大吸收波长为260nm,蛋白质对紫外光的最大吸收波长是280nm,三、核酸的紫外吸收,1 OD260 =DS DNA 50 gSS DNA 37 gRNA 40 g,紫外分光光度法检测核酸的纯度,通过测定波长在260nm和280nm处吸光度的 比值(A260A280)来估计核酸样品的纯度,DNA溶液： A260A280=1.8,RNA溶液：A260A280= 2.0,方法：,三、核酸的变性、复性及杂交,变性：DNA变性是指双螺旋的DNA分子双链解开形成单链的过程。由于双螺旋的稳定是靠碱基堆砌力及氢键来维持，所以DNA变性是不伴有共价键的断裂 引起DNA变性的因素有：加热、化学因素（有机溶剂、酸、碱、尿素）和机械力,分子的热变性,双螺旋结构即遭破坏，氢键断裂，双链分离。,将的稀盐溶液加热至8095(或以上)数分钟，,Tm：DNA热变性是在一很窄的温度范围内进行，这个温度范围的中点叫解链温度。用Tm值表示。它表示有50的DNA分子解链时的温度 增色效应：变性后的DNA分子溶液在260nm处的光吸收增加的现象,DNA的变性在紫外吸收上的变化,Tm的定义,影响Tm的因素1.DNA 的均一性越高,Tm的温度范围越小。2.G-C含量越高, Tm的值越大，当GC的含量上升1%，则Tm上升0.4。Tm = 69.3+0.41(G+C)% 或GC%=（Tm-69.3）2.44,3.介质的离子强度较高时, Tm的值较大4.酸性条件下,核酸容易脱嘌呤,碱性条件下,核酸容易变性,通常加NaOH 降低Tm的值5.尿素,甲酰胺等化学试剂可以降低Tm的值,称作变性剂,复性：DNA变性后，当温度缓慢下降时，解开的双链可以重新締合形成双螺旋的过程，称之为DNA的复性 DNA变性复性是否可逆以及可逆性的程度可人为加以控制,核酸分子的杂交,变性,复性,基于核酸变性和复性的原理，并依据碱基间互补配对的原则而建立的一门技术。主要用于确定两种相同或不同的核酸分子间同源性的鉴定,第六节 核酸酶,指所有可以水解核酸的酶,一、分类,1. 按照作用底物的不同分,DNA酶（DNase):,水解DNA,RNA酶（RNase):,水解RNA,2. 按照作用的部位分,核酸外切酶：,作用于5或3末端,核酸内切酶：,作用于链的内部,二、限制性核酸内切酶,作用于链的内部，,具有严格序列依赖性。,切基因工程的手术刀,没有限制性内切酶的发现和应用，就很难有今天分子生物学与基因工程的快速发展。,功能：,根据需要在特定的位点精确切割 双链DNA分子,基因工程中最常用的工具酶之一,