18,1,实验一 纸层析法分离鉴定氨基酸,通过实验，掌握纸层析的基本操作技能。 加深对分配层析原理的理解。,【一、实验目的】,18,2,【二、实验原理】 层析技术 是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。 可分离物质 糖类、有机酸、氨基酸、核苷等,18,3,固定相 在层析中起分离作用而不随层析过程移动的物质。如纸层析中固定相是滤纸纤维中结合的水。固定相被看成是样品移动的阻力。 流动相 在层析过程因其本身流动而推动样品移动的物质。,18,4,层析的分类,18,5,分配层析：是利用不同物质在两种不相溶的溶剂中的分配系数不同而达到分离的一种技术。,分配系数 =,溶质在固定相的溶解度,溶质在流动相的溶解度,18,6,纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析：纸纤维上的 OH 基具有亲水性，所以能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。流动相流经支持物时与固定相间连续抽提，使物质在两相间不断地分配而得到分离。,18,7,溶质在滤纸上的移动速率用f（比移）值来表示： 展层层斑点中心与原点间的距离 Rf = - 溶剂前沿与原点之间的距离,18,8,18,9,影响Rf值的因素（多种） 物质结构与极性 物质的极性大小决定了物质在水 和有机溶剂之间的分配情况。,pH值 展层剂的pH影响被分离物质的极性基团的解离形式。,层析滤纸的质量 层析用滤纸要质地均匀，紧密， 有一定的机械强度，并含杂质少。国产新华滤纸可 用于一般的纸层析。,18,10,【三、器材与试剂】 器材： 1、层析缸 2、毛细管 3、喷雾器 4、培养皿 5、层析滤纸(新华一号) 试剂： 1、扩展剂 （正丁醇：水：冰醋酸= 4：3：1） 2、显色剂 0.1茚三酮正丁醇溶液。 3、氨基酸溶液 0.5的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液 及它们的混合液,18,11,1、层析滤纸准备：取层析滤纸(长20 cm、宽15 cm)一张。在纸的一端距边缘23 cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号。 2、点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这5个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径，最大不超过3 mm。,【四、实验步骤】,18,12,3、扩展 ：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1 cm）。待溶剂上升约15 cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 4、显色： 用喷雾器均匀喷上0。1茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100)或用热风吹干即可显出各层析斑点。 5、计算Rf值,18,13,【五、实验结果与分析】,【六、注意事项】,【七、思考题】,1、实验中作为固定相和流动相的物质分别是什么？ 2、Rf值的含义、影响因素？,下次实验 ： 实验二 蛋白质和氨基酸的颜色反应,值 日 生 值 日,18,14,小实验,当滤纸接触到溶剂时，溶液将上升。 滤纸上的小圆点是4种不同的氨基酸的混合物。 看看接下来会发生什么事情,18,15,可以看出1号氨基酸上升的最高，在滤纸上跑得最快。 而4号氨基酸与滤纸的结合最紧，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。,18,16,这就是纸色谱法。 对照上图，可知道1-4号的各代表什么氨基酸。 纸色谱法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。,18,17,纸色谱小实验动画演示,18,18,