1,薄层色谱简介陈 新2006.08,QC基础技能,2,QC基础技能,主题一原理 二固定相 三展开剂 四操作方法 五定性分析 六定量分析 七Rf值与化学结构关系,3,一原理 1薄层色谱法是把吸附剂（或载体）均匀地铺在一 块玻璃板、铝箔或塑料板上形成薄层,在此薄层上进行色谱分离,称为薄层色谱法。待分离的样品点在薄层的一端，在密闭的容器中，用适宜的流动相或展开剂展开。由于吸附剂对不同的吸附力大小不同，易被吸附的组分移动地慢一些，而较难被吸附的组分流动地快一些。经过一段时间的展开，不同的物质彼此分开，最后形成互相分离的斑点。,4,2将试样点在色谱滤纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。 3薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用。,5,4比移值（R)： 溶质移动距离与流动相移动距离之比A， B为样品溶液点样的位置，如图1所示：,6,在一定色谱条件下， Rf值为常数，其值在01之间，若某组分Rf =0，表示它不随展开剂移动，吸附剂对它的吸附力很强，留在原点不动。若Rf =1，表示吸附剂对它基本不吸附，随着展开剂到达溶剂前沿，K=0。 Rf值越小，表示该组分K越大，极性越大。根据物质的化学结构不同，极性不同，在同一薄板上展开，我们能预测它们的Rf 值大小 。,7,5、分离度（ Rs）衡量分离效果的指标可用分离度Rs表示，其定义为，相邻两斑点的斑点中心至原点的距离之差与两斑点的宽度总和之半的比值，即如图2所示：,8,二、固定相薄层色谱法所用的固定相最常用的是硅胶。粒度要求比柱色谱更细，普通薄层硅胶粒度在40um左右，展开1015cm。高效薄层色谱硅胶粒度小至10um，5um，展开距离为5cm左右。薄层色谱展开后的斑点一般都比较集中。,9,三、展开剂薄层色谱法中选择展开剂的一般规则与吸附柱色谱法中选择流动相的规则相同。极性大的样品需用极性较大的展开剂，极性小的样品用极性小的展开剂。通常先用单一溶剂展开，根据被分离的物质在薄层上的分离效果，进一步考虑改变展开剂。一般希望Rf值在0.20.8之间，如果值较大，斑点都在前沿附近，则应加入适量极性较小的溶剂（如环己烷，石油醚等）以降低展开剂的极性。,10,调节被测组分的Rf值大小，除可改变展开剂的极性外，还可通过改变板的活度来到达。一般薄层板的活化温度为105，活化1h，若要降低板的活度，可通过降低板的活化温度如105 降为80 、60 ，均可达到降低板的活度目的。在活度小的板上，吸附剂对各组分的吸附力小，而Rf值会升高。,11,四、操作方法薄层色谱法一般操作程序可分为制板、点样、展开和显色4个步骤。,12,13,1、制板制备薄板所用的玻璃板必须表面光滑、清洁，不然吸附剂不易涂布，同时可能影响分离和检测；其大小可根据实际需要自由选择，小至载玻片，大的用20cm20cm玻片。 薄板可分为加粘合剂的硬板和不加粘合剂的软板两种。,14,a. 软板的制备将吸附剂撒在玻璃板的一端，另取比玻璃板宽度稍长的玻璃管，在管的两端各包上橡皮膏，也可以套上塑料管或橡皮管，其厚度即为薄层的厚度。 b. 硬板的制备硬板即粘合薄层，即在吸附剂中加入粘合剂。常用的粘合剂有羧甲基纤维素钠（CMC-Na)和煅石膏(CaSO41/2H2O)。,15,硅胶- CMC-Na板制备：取CMC-Na7.5g加1000mL水，加热使溶解，放置使澄清。取上清液100mL，分次加入硅胶约33g，调成糊状。将糊状的吸附剂倒在清洁的玻璃板上，使均匀流布于整块玻璃板上，平放自然晾干，105活化1h，置干燥器中备用。,16,2、点样将样品溶于适当溶剂中，尽量避免用水，因为水溶液斑点易扩散，且不易挥发除去，一般用乙醇、甲醇等有机溶剂。若为液体样品，可直接点样。原点直径为24mm，溶液宜分次点加，每次点加后，使其自然干燥，或用电吹风机促其迅速干燥，只有干后，才能点第2次。,17,点样工具一般采用毛细管或微量注射器，点样时必须注意勿损伤薄层表面，进行薄层定量时，用毛细管点样时最好不与薄层直接接触。点样量一般以几微升为宜。,18,3、展开展开缸一般为长方形密闭玻璃缸，粘合薄层常用上行法展开，将薄层板直立于盛有展开剂的色谱缸中，展开剂浸没薄板下端的高度不超过0.5cm，薄板上的原点不得浸入展开剂中。待展开剂前沿达一定距离，如1020cm时，将薄层板取出，在前沿处作标记。使展开剂挥散后，显色。,19,在展开之前，薄层板置于盛有展开剂的色谱缸内饱和15min，此时薄板不与展开剂直接接触。待色谱缸内，展开剂蒸气，薄层与缸内大气达到动态平衡时，也称为饱和时，再将薄板浸入展开剂中。这样操作可以防止边缘效应。边缘效应是同一化合物在同一块板上，因其点样位置不同，而Rf值不同。处于边缘的点样点，其Rf值大于中心点。其原因是由于展开剂在未达饱和的色谱缸内不断地蒸发，蒸发速度从薄层中央到两边逐渐增加，使边缘上升的溶剂较中央多，致使近边缘溶质的迁移距离比中心处大，导致边缘的Rf值大。,20,薄层展开方式除上行法外，还有径向展开法（薄板为圆形），多次展开法（同一展开剂，重复多次展开），双向展开法（展开一次后，换90用另外一种展开剂展开，适用于非常复杂的样品）。对软板展开，则多用倾斜上行法。,21,4、显色显色方法有下列4种： a.首先在日光下观察，划出有色物质的斑点位置。 b.在紫外灯（254nm或365nm）下，观察有无暗斑或荧光斑点，并记录其颜色，位置及强弱。有荧光的物质或少数有紫外吸收物质可用此法检出。,22,c. 荧光薄层板检测，适用于有紫外吸收的物质。荧光薄层是在硅胶中掺少量荧光物质，如硅酸锌锰，制成的板，在254nm紫外灯下，整个薄层板呈黄色荧光，被测物质由于吸收了部分照射在此斑点位置的紫外线，而呈现各种颜色的暗斑。,23,d. 既无色，又无紫外吸收的物质可采用显色剂显色。用硫酸乙醇液显色，大部分有机化合物能呈显不同颜色的斑点。碘蒸气显色也是有机化合物良好的显色剂。 其它显色剂利用物质的特性反应显色，如氨基酸，可喷茚三酮试剂，多数氨基酸呈紫色，个别氨基酸呈黄色。对还原性物质，含酚羟基物质，可喷三氯化铁-铁氰化钾试剂。,24,五、定性分析对斑点的定性鉴别主要依靠Rf值的测定。常采用的方法是用已知标准物质作对照。将样品与标准点在同一块薄层上展开，显色后，根据样品的Rf值及显色过程中的不同现象与标准品对照比较进行定性鉴定。与紫外光谱用于定性时的情况类似，仅根据一种展开剂展开后得到的Rf值作为定性依据是不够的，需要经过两种以上不同组成的展开剂得到的Rf值与标准品一致时，才可基本认定该斑点与标准品是同一化合物。,25,六、定量分析薄层色谱法的定量分析采用仪器直接测定较为准确，方便。但一些简易的方法有利于薄层色谱法的推广。,1.目视比较法 2.洗脱法 3.薄层扫描法,26,七、 Rf值与化学结构的关系化合物在两相中的分配系数的大小，直接决定于化合物的分子结构。一般讲，化合物的极性大或亲水性强，在水中分配量多，则在以水为固定相的纸色谱中Rf值小。如果极性小或亲脂性强，则Rf值大。应该根据整个分子及组成分子的各个基团来考虑化合物的极性大小。,27,谢谢!,