动物基因组DNA/RNA 提取及含量测定,指导教师:王国彦,目的要求,学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术 了解提取DNA/RNA的几种方法，原理和优缺点 学习测定DNA/RNA含量的基本原理及具体方法,实验原理,核酸和蛋白质是构成生物有机体的主要成分；核酸是生命的最基本物质。在生物体中它们结合成核蛋白的形式存在。核酸按其化学组成可以分成两大类，一类含D-R-脱氧核糖的称为脱氧核糖核酸（DNA），主要存在于细胞核中；另一类含D-核糖的称为核糖核酸（RNA),主要存在于细胞质内；由于核酸极不稳定，在较剧烈的化学。物理因素和酶的作用下很易降解，因此在制备时应防止过酸、过碱及其它引起核酸降解的因素作用。,在提取中为防止组织中广泛存在的核酸酶降解的作用，应在低温下进行，必要时加入抑制剂，如柠檬酸盐、氟化钠、砷酸盐等，皂土也可抑制DNA酶的活性，如果采用（SDS)或苯酚作蛋白质变性剂来分离核酸，它们同时也可以使核酸降解酶破坏，因此常获得较好的效果,一RNA的提取与测定,由于RNA的种类来源很多，因而提取制备方法各异，一般有苯酚法，去污剂法和盐酸胍法，其中苯酚法实验室最常用。组织匀浆后用苯酚处理离心，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，向水相加冷乙醇后， RNA即以白色絮状沉淀析出。此法较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的RNA,工业上常用稀碱和浓盐酸法提RNA，用这两种方法提取的核酸均为变性RNA。主要用于制备核苷酸的原料。其工艺较简单，浓盐法是用10氯化钠的溶液，在90摄氏度提取34小时，冷却，离心，上清液乙醇沉淀RNA。稀碱法用0.2氢氧化钠是酵母裂解，然后酸中和，除蛋白和菌体，上清液乙醇沉淀的RNA ,或调核酸等电点PI2.5沉淀。,RNA广泛存在啤酒酵母，西点酵母，酒精酵母和各种动物组织中。 本实验用动物肝脏经组织捣碎，制成组织匀浆，用0.14mol/L氯化钠溶液提取。把细胞之中的核糖核蛋白提取出来，留下含有DNA的细胞核物质，调节PH4.5再将RNA和PI分开，一位在0.14mol/L氯化钠溶液中，RNA蛋白溶解度大。DNA蛋白溶解度低，而在1mol/L氯化钠溶液中溶解度最大。,RNA含量测定,RNA含量的测定方法很多：紫外吸收法、定磷法、常用地衣酚测定其原理是：当RNA与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核酸继而转变成糠醛，后者与3.5二羟基甲苯（地衣酚）反应，在铁或铜离子催化下，生成鲜绿色复合物，反应在670nm处有最大吸收峰，RNA浓度在10-100g/ml范围内，光吸收与RNA浓度成正比，地衣酚特异性差，凡戊糖均有些反应。,试剂和器材,材料：动物肝脏 试剂： 0.14mol/L氯化钠 标准RNA溶液： 100g/ml 地衣酚试剂(现用现配) 80苯酚溶液 95乙醇 器材：匀浆器、离心机、分光光度计、烧杯、量筒等,操作方法,RNA提取： 匀浆：称取3克牛肝剪碎，加20ml 0.14mol/L氯化钠溶液10000rn/min左右匀浆1分钟左右 离心：匀浆后溶液离心8000 rn/min离心7分钟，量取上清夜毫升数，沉淀物留做提取DNA用 除杂质：加等体积80酚溶液于上清液中，搅拌充分混合1020分钟，置冰箱冷却静止30-40分钟，离心取上层水相含有RNA，弃下层酚相含蛋白质和DNA等杂质 沉淀RNA:取上层水相含RNA溶液，加入2倍体积95冷乙醇，搅拌，充分混合，置冰箱中冷却，至出现白色絮状物RNA，离心8000 rn/min离心7分钟，取沉淀物 溶解：用少量去离子水（约4毫升）溶解沉淀物，用以测定其含量,RNA含量测定,取两支试管各加入0.4ml、0.6ml待测液，再加1.6ml和1.4ml水和2.0ml地衣酚试剂，加毕，摇匀，沸水加热25分钟，取出后冷水冷却，测定各管OD670为纵坐标，RNA浓度为横坐标作图并计算提出的RNA 的量和收率。(控制RNA浓度在10-100g/ml之内）,思考题RNA提取方法有几种？有什么优缺点？ RNA提取过程中应注意什么？,DNA的提取及含量测定,DNA提取小牛胸腺，鱼类精子和植物种子的胚等含有丰富的DNA，动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白可溶于水或浓盐溶液，如1mol/l氯化钠，但在0.14mol/l氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白则在0.14mol/l氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开，分离得到DNA蛋白 将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS)溶液，使其DNA与蛋白质分离开来，蛋白变性，冷却，离心除蛋白，加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/l，则DNA溶解，加95乙醇沉淀DNA，即得粗DNA，也可进一步重复操作得较纯DNA.,经常采用三种方法去除蛋白,用SDS等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA 苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白质和DNA，分层、离心蛋白变性，因而抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较缓和，可以得到较好的DNA制品 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化，离心除蛋白，DNA在上层水相，用乙醇沉淀上层，可将DNA沉淀出来,DNA含量的测定,原理：强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中2脱氧核糖在酸性环境中成为羟基酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400g范围内光密度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。,试剂和器材,试剂： 生理盐水 10SDS 氯化钠 95乙醇 DNA标准溶液：用0.01mol/lNaOH配成200g/ml溶液 二苯胺试剂(现用现配) 器材：恒温水浴、分光光度计、移液管等,操作方法,DNA的提取： 溶解：将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌全溶解后，加3毫升10SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1，边加边搅拌，放置冰箱中，静止约30分钟 除蛋白：离心上述溶液， 8000 rn/min离心7分钟，取上清液量好体积，加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到1mol/l,充分搅拌，使DNA溶解，离心，取上清液 沉淀：准确量取上清液体积，加2倍体积95冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约30-50分钟，离心8000 rn/min离心7分钟，得白色沉淀 溶解：将沉淀物用0.1mol/lNaOH约4毫升溶解，做含量测定用,DNA含量测定,1.DNA标准曲线的制定 去6支试管，依次加入0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mlDNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2ml。然后各加入4ml二苯胺试剂，混匀。于60 恒温水浴中保温1h，冷却后于595nm处进行比色测定。以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 2.制品的测定 取2支试管，各加2ml待测液（内含DNA应在标准曲线的可范围之内）和4ml二苯胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线的制作。 3. 根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量，按下式计算出制品中的百分含量： 待测液中得的DNA微克数 DNA%=100% 待测液中制品的微克数,思考题,二苯胺法测定DNA，为什么加乙醛，作用是什么？ 除杂质常用那些方法？,