第十一章 细胞增殖与细胞分裂,细胞增殖及其调控,前言,细胞增殖是细胞生命活动的重要特征之一，是生物繁育的基础。 各种细胞在分裂之前，还必须进行一定的物质准备。物质准备和细胞分裂是一个相互连续的过程，这一过程即为细胞增殖(cell proliferation)。 需要在细胞中必须有一个严格的监控系统，监控着细胞周期运转中每一个环节，从而保证遗传的稳定。,研究细胞周期与细胞分裂的意义,绝大多数真核生物个体生长繁殖的基础； 使遗传物质DNA在细胞世代中得以延续的保证； 高等生命通过细胞的有丝分裂结合细胞分化，形成组织、器官、系统完成生命活动； 此过程机制复杂，搞清楚对癌症治疗具重大意义；,细胞增殖有十分精确的调控机制，表现出严格的时间和空间的顺序性，如果异常就会产生疾病。如造血细胞生成的速率小于血液中细胞死亡的速率，就会造成贫血； 机体局部细胞无休止的分裂就会产生肿瘤； 细胞增殖过程中染色体分配异常就会导致染色体病。所以探讨细胞增殖的机理对于医学的理论和实践有十分重要的意义。,第一节 细胞周期与细胞分裂,一、细胞周期 (一)细胞周期概述 1细胞周期的发现： 细胞有丝分裂期(mitosis)和位于两次分裂期之间的分裂间期(interphase)或静止期； 1953年，Howard和Pelc的32P标记蚕豆实生苗根尖实验发现：DNA的复制仅发生在静止期中的一个区段； 将细胞周期划分为4个时期：S期(DNA合成期)、 M期(有丝分裂期)、 G1期(M期结束到 S期之间的间隙)、 G2期(S期结束到 M期之间的间隙)。细胞在细胞周期中顺序经过 G1-S-G2-M而完成其增殖。,2、细胞周期 是指连续分裂的细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个序贯过程。在这一过程中，细胞遗传物质复制，各种组分加倍，然后平均分配到两个子细胞中。,细胞周期时间,不同生物细胞的细胞周期时间有差异，同一系统中不同细胞，其细胞周期时间也有很大差异。一般说来，S+G2+M的时间变化小，而G1期的持续时间差异可能很大。有的细胞如胚胎细胞可能缺乏G1期， V79-8系细胞为G1和G2期的缺乏细胞系。,3周期中细胞，终端分化细胞， G。期细胞,从增殖的角度，细胞可分为三类：连续分裂的细胞，静止期细胞和终端分化细胞。 连续分裂的细胞即在细胞周期中连续运转的细胞，因而又称周期中细胞。小肠绒毛上皮隐窝细胞，表皮基底层细胞，部分骨髓细胞够均属此类。 静止期细胞为暂时脱离细胞周期，不进行增殖，但在适当刺激下可重新进入细胞周期的细胞，如某些免疫淋巴细胞，肝、肾细胞等，也称为 G。期细胞。 终端分化细胞是指那些不可逆地脱离细胞周期，丧失分裂能力，保持生理机能活动的细胞，如神经、肌肉细胞、多形核白细胞等。,(二)、细胞周期时相及其主要事件,1细胞周期检验点(cell cycle checkpoint),细胞周期的有序运转是cdc（cell division cycle)基因有序表达的结果，cdc基因的有序表达是受周期中一些检验点或称为调控点调节的。 通过上述各个检验点保证了产生具有正常遗传性能和生理功能的子代细胞，如果这些调控途径异常，导致遗传性能紊乱、增殖分化异常和细胞癌变，甚至导致死亡。,Cell cycle,2. G1期关键事件,合成细胞生长所需要的各种蛋白质、糖类、脂质等，但不合成DNA。 限制点(restriction point，R点)，或检验点(check point)是G1期晚期的一个基本事件： 影响这一事件的外在因素主要包括营养供给和相关的激素刺激等；而内在因素则主要是一些与cdc基因调控过程相关因素。 肿瘤抑制基因p53等监控细胞DNA完整性，在G1期检验点中起负调控作用。 染色体处于复制前感受状态或允许(licensing)状态。,3S期关键事件,(1)S期的启动- S期促进因子(S-phase promoting factor， SPF),（2）真核生物染色体的复制, 真核生物 DNA复制的特点 多个复制起点成簇活化，向两个方向以复制叉方式进行延长； S期DNA复制的不同步特性： 大多数有转录活性的常染色质复制较早，异染色质复制晚。早S期复制的DNA GC含量较高，晚S期复制的DNA AT含量较高。呈周期性重现； 大多数与DNA合成有关的酶系在G1S交界或早S期升高。,组蛋白的合成与核小体的组装,组蛋白的合成主要在 S期，在 S期组蛋白 mRNA的水平可增加50倍。与DNA合成之间存在联动反馈机制，保证组蛋白形成的数量能相应于新合成的 DNA数量。 核小体组装与“半核小体” 复制模型 组蛋白合成后被修饰，可进行磷酸化、乙酰化、甲基化和ADP-核糖基化作用，其中组蛋白的磷酸化和乙酰化被认为在调节细胞周期前进中和基因表达方面起重要作用。,4G2期关键事件,主要与细胞进入M期所需的多种结构与功能的准备有关： M期染色体凝集的相关事件，如由于H1组蛋白磷酸化的缺陷，阻止了染色体的凝集，导致停止在G2期。 有丝分裂纺锤体的形成与发挥作用的相关事件。 核糖体的存在与数目对于完成 G2期和进入有丝分裂的进程也是起重要作用的。 细胞周期调控分子活化，通过 G2M期检验点(G2M checkpoint)，使细胞进入M期 。,(三)测定细胞周期及各时相时间的方法,（1）标记有丝分裂百分数法（PLM）：,标记有丝分裂百分率法对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。放射标记物为3H或者14C标记的TDR。,T,PLM,常以（TG2+1/2TM）-TG2的方式求出TM,（2）流式细胞分选仪测定法,One of the earliest applications of flow cytometry was the analysis of cell cycle position by quantitation of cellular DNA. Flow cytometry is still the method of choice for fast, accurate determination of cell cycle distributions.,Laser,Fluorescence Detectors,Univariate Cell Cycle Methods,In the simplest method, cellular DNA is detected using a fluorescent dye that binds preferentially to DNA. Propidium iodide is most commonly used. It undergoes a dramatic increase in fluorescence upon binding DNA. It requires permeabilization of the plasma membrane. Hoechst 33342 can be used where labeling of unpermeabilized (live) cells is desired.,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,s,DNA Analysis,DNA content,Count,Normal Cell Cycle,Purdue University Cytometry Laboratories,0,200,400,600,800,1000,PI Fluorescence,DNA Analysis,2N,4N,Purdue University Cytometry Laboratories,488 nm laser,-,Fluorescence Activated Cell Sorting,Charged Plates,Single cells sorted into test tubes,FALS Sensor,Fluorescence detector,(四)、细胞周期同步化,（一） 细胞同步化的概念细胞同步化是指在自然过程中发生的，或经人为处理造成的细胞周期同步化。前者称为自然同步化，后者称为人工同步化。 1.自然同步化在自然界中，细胞自然同步化的现象在动、植物及粘菌中都有所发现，它们不受人为条件的干扰，因而有可能在接近自然的条件下进行观察。,多核体粘菌(Physarum polycephalum)的变形体(plasmodia)只进行核分裂而不同时伴有细胞质的分裂，因而形成多核体；数量众多的核处于同一细胞质环境中进行同步化分裂，核可多达107，细胞大小可达5-6cm。如果将其切成许多小块，每一小块中的核进行同步分裂，而不同小块之间并非同步，若将不同小块融合在一起则又进行同步化分裂。 某些水生动物受精卵的同步分裂 增殖抑制解除后细胞的同步分裂,2. 人工同步化的原理及分类,人工同步化大致可分为选择同步化，诱导同步化或两者的结合。 （1）人工选择同步化 有丝分裂选择法（反复振摇法）：Prescott(1956)利用有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的附着性降低的特点。此法的特点是细胞不受药物等的伤害，同步化程度高，放入37环境中收集的细胞即可同步分裂。缺点是分裂细胞一般占1%-2，对于一些生化分析仍感细胞数不够。, 密度梯度离心法：,在某一离心力场中的沉降速度与其半径平方成正比：周期时相不同而细胞大小不同。将高密度单个细胞悬液置于事先制备好的蔗糖密度梯度上，然后离心沉降或重力自然沉降。分层收集即可获得不同周期阶段的细胞。此法的优点是可适用于任何系统包括悬浮生长的细胞。缺点是同步程度有限，因同一时相的细胞大小并非都一致。,（2）人工诱导同步化, DNA合成阻断法：选用DNA合成抑制剂可逆地抑制DNA合成而不影响其他期细胞沿周期运转，最终可将细胞群体阻断在S期。 5-氟脱氧尿嘧啶，羟基脲，阿糖胞苷，氨甲喋吟，5-氨基尿嘧啶，高浓度AdR，GdR和TdR，均可抑制 DNA合成而使细胞同步化。其中高浓度TdR对S期细胞的毒性较小，阻断效果较好，因此成为较常使用的 S期阻断剂。,TdR双阻断法: 是最常使用的方法,向对数增殖期的培养细胞的培液中加入TdR，使细胞阻于S期和G1-S期交界处。 当移去TdR，洗涤细胞。当释放时间大于ts时，所有细胞均脱离S期，这时再给予第二次 TdR阻断。 细胞群体再经过G2+M+G1的时间，则细胞阻断于G1-S交界处的一个狭窄的区段中（ tG1+tG2+tmts ） 。,优点是同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化。 缺点是诱导过程造成细胞非均衡生长(蛋白质、 RNA合成并不停止)，细胞体积增大，较正常细胞在周期上有差异，有时出现有丝分裂和染色体的异常。分裂中期阻断法： 某些药物可抑制微管的聚合，将细胞阻断于有丝分裂中期。 非平衡生长问题不十分明显。但长时阻断释放后许多细胞不能完成正常的有丝分裂而进行异常分裂。 中期阻断药物最常用者为秋水仙素或其衍生物秋水仙酰胺。,（3）条件依赖性突变株,(五)、特异的细胞周期,1早期胚胎细胞的细胞周期 早期胚胎细胞的细胞周期主要指受精卵在卵裂过程中的细胞周期。 显著的特点： 当受精以后，受精卵便开始迅速卵裂，卵裂球数量增加，但其总体积并不增加，因而，卵裂球体积将越分越小； 每次卵裂所持续的时间，即一个细胞周期所持续的时间，大大短于一个体细胞周期所持续的时间； 细胞周期调控因子和调节机制与一般体细胞标准的细胞周期基本是一致的。,2酵母细胞的细胞周期,酵母细胞周期的特点：酵母细胞周期运转过程也包括G1期、S期、G2期和M期等4个时期。参与调控细胞周期的基因与高等生物也基本相同。 酵母细胞周期持续时间较短，大约为90min。 细胞分裂过程属于封闭式，即在细胞分裂时，细胞核核膜不解聚。与细胞核分裂直接相关的纺锤体不是在细胞质中，而是位于细胞核内。 在一定环境因素作用下，也进行有性繁殖。,