第二章 基因工程制药,第一节 概述 第二节 基因工程药物生产过程 第三节 目的基因的获得 第四节 基因表达 第五节 基因工程菌的生长代谢特点 第六节 基因工程菌的稳定性 第七节 基因工程菌的中试 第八节 基因工程菌的培养 第九节 高密度发酵 第十节 基因工程药物的分离纯化 第十一节 变性蛋白的复性 第十二节 基因工程药物的质量控制 第十三节 基因工程菌药物的制造实例,第一节 概述,基因工程在制药中作用 基因工程药物的主要类别：4类 基因工程生产药物的优点：5点 国内外基因工程药物发展简述 与国外先进水平的差距,基因工程(genetic engineering)就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。,稀少珍贵的蛋白质药物,1982年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品人胰岛素投放市场它标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。 人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等,畜牧业中的应用,动物疫苗、生长激素等,例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA,种植业中的应用,用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生质体，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过原生质体的培养分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株转基因植物,种植业中的应用,抗化学除草剂基因 转基因西红柿 固氮酶基因 人类DNA ,环境保护等等,第二+三节 基因工程基本过程,1 重组DNA技术是基因工程的核心技术 2 获得需要的目的基因（外源基因） 3 构建重组质粒和基因克隆 4 转化受体细胞和转化子的筛选 5 转化子的分析Southern杂交,重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。,1 重组DNA技术是基因工程的核心技术,重组DNA操作一般步骤：,（1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子； （3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传； （4）对转化子筛选和鉴定； （5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。,（1）构建基因文库，然后从中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； （3）聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因片段 （4）对旧基因的改造 （5）化学合成（短）基因,2 获得需要的目的基因基本方法,细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建,细胞内总DNA的提取分离程序,紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。,基因文库的构建将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。,反转录人工合成互补DNA,构建基因文库获取目的基因存在的问题费时费事内含子序列,反转录人工合成互补DNA方法的优势获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因,聚合酶链式反应（PCR）,PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。,加入4种物质：（1）作为模板的DNA序列； （2）与被分离的目的基因两条链 各自5端序列相互补的 DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）； （3）TaqDNA聚合酶； （4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。,聚合酶链式反应（PCR）,变性、退火、延伸三步曲,变性：双链DNA解链成为单链DNA 退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,聚合酶链式反应（PCR）,每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍,30轮循环可获得 230（1.07109)个基因片段,改造旧基因 化学合成（短）基因,基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶、载体和宿主菌。 微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后，才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。,3 构建重组质粒和基因克隆,限制性内切酶,限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点分子手术刀 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年诺贝尔奖。,限制性内切酶,已经发现和鉴定了200多种,EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段 粘性末端 T4连接酶,载体,载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。 质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。,a该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。 b进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复制形成大约500个拷贝。 c在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种限制性酶切位点的序列，即多克隆位点,细菌质粒pUC18,pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG和X-gal，X-gal便会被半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆,d利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒,epUC18还携带了氨卞青霉素抗性基因，可筛选重组质粒。,以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆,将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤： a获得目的基因和质粒载体； b形成重组质粒； c制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞； d培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝； e筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。,一般克隆基因的检查和鉴定方法,琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动电场驱动力和凝胶阻力不同迁移率分子量标准参照物,酶切和电泳方法,32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法,DNA杂交直接鉴定,基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。这一过程就是遗传转化。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和积累。对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。 通过DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物,4 转化受体细胞和转化子的筛选,遗传转化常用的方法,载体法转化农杆菌介导法 基因的直接转移 （1）高压电脉冲电激穿孔 （2）基因枪法 （3）微注射法,纪念发明者Edward Southern （1）提取总DNA （2）酶解 （3）电泳 （4）转移到滤膜 （5）变性解链 （6）DNA探针及杂交 （7）洗脱 （8）放射自显影 （9）比较分析,5 转化子的分析Southern杂交,Southern杂交分析示例,A. DNA体外重组实验B. 抗生素筛选转化子细胞C. 培养突变株细胞D. Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中,1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。,第四节 基因表达,宿主细胞的选择 大肠杆菌中的基因表达 酵母中的基因表达 动物细胞中的基因表达,一、宿主细胞的选择,宿主细胞的必备条件：7要点 基因表达宿主细胞可分为2大类别 常见的基因表达宿主1. 原核细胞：3种2. 真核细胞：3种 以上各宿主的特点是什么？,二、大肠杆菌中的外源基因表达,1. 真核基因在大肠杆菌表达载体的6个必备性质 2. 2个表达载体pBV220 & pET system 3. 影响目的基因表达的5大因素 4. 真核基因在大肠杆菌的3种表达形式,三、外源基因在酿酒酵母中的表达,1.载体： 4大类，Yep, YRp, YCp, YIp 克隆载体与穿梭载体 表达载体：普通表达载体和精确表达载体。 2.影响目的基因在酵母细胞表达的因素 外源基因的剂量 外源基因的表达效率 外源蛋白质的糖基化 宿主菌株的影响,第五节 基因工程菌株的生长代谢,菌体生长与能量的关系关键词：供氧/能量/副产物/菌体生长菌体生长与前提供应的关系关键词：前提物/,基因工程菌株的不稳定性 菌株的稳定性与质粒的稳定性 提高质粒稳定性的6种方法,第六节 基因工程菌株的不稳定性,第八节 基因工程菌株的培养,1. 基因工程菌株的发酵（发酵）方式 基因工程菌株的发酵工艺 基因工程菌株的发酵设备,第九节 高密度发酵,高密度：概念与作用 影响高密度发酵的因素 如何达到高密度发酵,建立分离纯化工艺的依据 分离纯化的基本步骤 分离纯化的技术1. 如何选择合适的分离纯化工艺2. 细胞破碎和固液分离3. 目标产物的分离纯化 选择分离纯化工艺的依据1. 根据产物的表达形势来选择2. 根据分离单元之间的衔接来选择,第十节 基因工程药物的分离纯化,原材料的质量控制 培养过程中的质量控制 纯化工艺过程中的质量控制 目标产品的质量控制 1.产品的鉴别 2.纯度分析 3.生物活性测定 4.稳定性 5.产品的一致性 产品的保存,第十二节 基因工程药物的质量控制,干扰素-人的IFN2b的制造 其他,第十三节 基因工程药物制造实例,第二章 思考题,1.为什么要通过基因工程的途径制药？ 2.请写出基因工程制药的基本流程。 3.如何获得一个目的基因？ 4.为什么要选择大肠杆菌或者酵母菌作为药物基因表达的宿主菌？ 5.大肠杆菌或者酵母菌中用于药物表达载体常见的有哪些？ 6.影响目的基因在宿主细胞中的表达效率的主要因素有哪些？ 7.如何提高基因工程菌中的质粒稳定性？ 8.基因工程菌的发酵工艺包含那些主要因素？ 9.基因工程药物分离纯化的基本步骤是什么？ 10.选择分离纯化方法的依据何在？应该遵循那些基本规则？ 以上每题8分 11.名词解释（每词2分）：融合蛋白/启动子/SD序列/pGB-2/穿梭载体/克隆载体/分泌型表达载体/精确表达载体/基因工程/PCR/,