第 二 章 基 因 研 究 技 术,制备技术 检测技术 文库构建 序列测定,制备技术,需要研究的DNA片段,化学合成法,cDNA文库 基因组DNA文库,聚合酶链式反应,制备技术,DNA分离与纯化 RNA分离与纯化 化学合成 基因扩增,DNA分离与纯化,植物基因组DNA 动物组织块DNA 细菌基因组DNA 质粒DNA,原理 机械研磨：破碎组织、裂解细胞； 等离子表面活性剂溶解：溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，使DNA游离； 有机溶剂（苯酚和氯仿）变性抽提：使蛋白质变性、抽提液分相，核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质； 乙醇沉淀：无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中。,操作要点 取材：新鲜幼嫩、容易获取； 液氮中研磨：材料易于破碎，减少研磨过程中各种酶类作用；叶片磨得越细越好；操作迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，DNA酶释放； 抗氧化剂或强还原剂：植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)，不利于DNA抽提，抽提缓冲液中加入抗氧化剂 (如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。 表面活性剂：十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，CTAB) 、十二烷基肌酸钠(sarkosyl) 、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS),植物基因组DNA,主要试剂 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 乙二胺四乙酸（EDTA） 氯化钠 2-巯基乙醇 无水乙醇 氯仿 异戊醇,CTAB抽提缓冲溶液：250ml 称取CTAB 4g，放入200 ml的烧杯，加入5 ml的无水乙醇，再加入100ml的三蒸水，加热溶解 依次加入56 ml 5M NaCl、20 ml 1M Tris-HCl ( pH8.0)、8ml 0.5 M EDTA，定容至250 ml 高压灭菌，降至室温 冷却后加入2ml的1% 2-巯基乙醇（400l），4保存 氯仿 : 异戊醇=24 : 1 TE缓冲液： pH8.0,实验步骤 CTAB抽提缓冲液在65水浴中预热； 取少量叶片置于研钵液氮中，用小杵磨至粉状； 加入700 l CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动摇匀； 65 水浴，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出； 冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇(24:1) 至满管，振荡23 min，使两者混合均匀； 10000 rpm 10 min，同时，将600 l 异丙醇加至新灭菌离心管中； 10000 rpm 1 min后，移液器轻轻地吸取上清液，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物； 10000 rpm 1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出； 加入800 l 75% 乙醇，将DNA洗涤 30 min； 10000 rpm 30s，立即倒掉液体，干燥DNA，自然风干或风筒吹干； 加入50 l 0.5 TE缓冲液，使DNA溶解； 置于-20保存、备用。,研磨、匀浆、SDS作用破碎细胞； 苯酚和氯仿使蛋白质变性； 用其混合液（酚:氯仿:异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质； RNase降解RNA； 得到纯净DNA分子。,动物基因组DNA,主要试剂 十二烷基硫酸钠（SDS） 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 乙二胺四乙酸（EDTA） 饱和酚、氯仿、异戊醇 无水乙醇 75%乙醇 蛋白酶K RNase酶,实验步骤 组织块解冻，生理盐水洗去血污，剪取约0.5g组织，放入1.5ml离心管中，剪碎， 于玻璃匀浆器中，加入细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块 (柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤) ； 加入0.45ml TE混匀，再加入50 l SDS（10%），5.0 l蛋白酶K（20mg/ml），充分混匀，56C保温4-6h，每2h摇1次； 放置到室温，加入等体积饱和酚（500 l ），颠倒混匀，10000r/m 10m，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1.5ml离心管；（不要吸起中间的蛋白质层 ） 加入等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），颠倒混匀，10000r/m 10m，取上层转移到新的1.5ml离心管中; 加入等体积氯仿:异戊醇（24:1），颠倒混匀，10000r/m 10m，取上层清液到一个新的1.5ml离心管; 加入2.5倍体积的-20C预冷无水乙醇沉淀DNA，观察现象; 12000 r/m 10m，弃乙醇; -20C保存的75%乙醇洗涤（不要荡起DNA ） ，10000 r/m 5m，去乙醇，55C干燥DNA; 加入适量TE溶解DNA（具体依DNA的多少而定），-20C保存备用。,细菌培养：37摇床培养过夜； 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，8000rpm 5min，沉淀悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O亦可)。 细菌裂解：加入6l 50mg/ml的溶菌酶，37作用2h。再加2mol/LNaCl 50l，10%SDS 110l，20mg/ml的蛋白酶K 3l，50作用3h或37过夜； 抽提：等体积酚氯仿异戊醇(25241)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次，取上清； 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min； 洗涤：沉淀用75%乙醇洗涤； 干燥：抽、晾干后，溶于50l ddH2O中，取2-5l电泳。,细菌基因组DNA,碱变性法 原理：共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段之间，拓扑学差异。 操作：pH值12.012.5，DNA变性； 冷却、恢复中性使复性，线性染色体形成网状结构，cccDNA可以准确迅速复性； 离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液； 乙醇沉淀，获得质粒DNA。,质粒DNA的提取,微量碱变性法 1、取1.5ml 含质粒的大肠杆菌过夜培养物，离心收集细胞沉淀； 2、加入100 l 冰冷的sol（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl pH=8.0，10mM EDTA，45mg溶菌酶）静置5分钟； 3、加入200 l 微冷的sol（0.2MNaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。65度水浴一段时间会加强染色体DNA的变性作用; 4、加入150 l 冰冷 pH4.8 3M乙酸钠，振荡，冰浴5分钟; 5、离心,上清液苯酚抽提数次，乙醇沉淀收集质粒DNA。,DNA的纯化 低熔点琼脂糖凝胶电泳法 透析电洗脱法 Glass milk（bead）结合法 Qiagen纯化柱,back,尿素-氯化锂法 硫氰酸胍法 polyT亲和层析法 密度梯度离心分级法 探针筛选法,RNA的分离与纯化,TRIzol：总RNA抽提试剂，直接从细胞或组织中提取总RNA。 苯酚、异硫氰酸胍、8-羟基喹啉、-巯基乙醇 ； 迅速破碎细胞； 蛋白质变性； 抑制细胞释放出的核酸酶； 保持RNA的完整性。,TRIzol配制 2000ml烧杯中加入以下物质，混合均匀：500ml重蒸苯酚、250g异硫氰酸胍、293ml蒸馏水、17.6ml 0.75M 柠檬酸钠溶液（pH7）、26.4ml 10%sarcosy十二烷基肌氨酸钠 、50ml 2M NaAc溶液（pH4 4低温保存，保质期一年,样品制备 匀浆/碾磨/裂解细胞，加入TRIzol，15-30C 5分钟以使核蛋白体完全分解，加入氯仿。 当样品富含蛋白质、脂肪、多糖或是细胞外物质，例如肌肉、脂肪组织、植物块茎部分时，需要特殊处理。 高丰度mRNA：从特定型别分化细胞分离细胞质，编码特种蛋白质的目的mRNA占总mRNA的5090，网织红细胞中的珠蛋白mRNA、鸡输卵管的卵清蛋白mRNA，还有免疫球蛋白、丝素蛋白和眼球晶体蛋白等的mRNA均为高丰度mRNA。 低丰度mRNA或稀有mRNA：总RNA集群中少于0.5，分离这类mRNA必须采用某些富集mRNA的方法，如按照大小对mRNA(或合成的双链cDNA)进行分级分离，或使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体等富集方法、Poly A。,polyT亲和层析法,polyT,polyT,polyT,密度梯度离心分级法,总mRNA样本,蔗糖 氯化铯,分离：1mlTRIzol加0.2 ml氯仿混匀，30C孵育2-3分钟；2-8C 12,000g15分钟，下层红色苯酚-氯仿层，中间层，上层无色水样层为RNA，体积约为所加TRIZOL容量的60%。 RNA沉淀：水样层转移，加入异丙醇/无水乙醇混合沉淀RNA；15-30C孵育10分钟，2-8C 12,000g10分钟。RNA形成胶状片状沉淀于管壁和管底。 RNA洗脱：用75%乙醇洗涤RNA沉淀一次，2-8C 7,500g5分钟。 RNA溶解：简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5-10分钟），加入适量体积Rnase free water。,RNA样品质量检测,操作要点 最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的内源性RNA酶(RNase)的活性； 避免偶然引入实验室内的外源性RNA酶。,back,将核苷酸单体按3 5磷酸二酯键连接，先合成出有一定长度、具有特定序列结构、具有两个单链(上下各重叠610个碱基)的寡聚核苷酸片段。 再将合成的寡核苷酸片段分别在5端加磷酸基团，退火拼接，用DNA连接酶连接，使它们按照一定的顺序共价地连接起来，得到合成的完整基因最后通过载体克隆，即得到克隆化的化学合成基因。,化学合成法,化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,目的基因化学合成法步骤 目的基因的设计 寡聚核苷酸片段的合成 寡核苷酸片段的分离和纯化 寡核苷酸片段组装目的基因 用激酶与连接酶组装基因 用聚合酶与限制酶组装基因,目的基因的设计：计算机设计完成，要点 寡核苷酸片段划分的长度：3050，50 合成效率不易控制，30 拼接基因效率不合理。 限制酶切位点：为了使基因克隆位点不重复，通过密码子简并性改换部分密码子，消除基因内部多余的酶切位点。 排除基因内部正反向重复顺序：正反向重复顺序(片段与片段间的重叠区)，将造成拼接效率的下降，甚至造成基因的错误拼接 选择表达宿主偏爱的密码子:不同宿主的偏爱密码子不同，选择表达宿主偏爱密码子利于基因高效表达 加起始与终止密码子 基因表达因素：根据所选择载体的不同，调整合适的阅读框，加核糖体结合位点，加信号肽及保守序列,寡聚核苷酸片段的合成方法 磷酸二酯法 磷酸三酯法 亚磷酸三酯法 固相合成法 自动化法 固相亚磷酸三酯法：最通用，合成长度50bp 固相载体(可控微孔玻璃，CPG),寡核苷酸片段的分离和纯化 合成终止时，固相载体上携带着被完全保护的寡聚脱氧核苷酸 苯硫酚脱去甲氧保护基，从固相载体上释放，成为游离的寡核苷酸 乙醇沉淀法纯化寡核苷酸 高效液相色谱法或凝胶电泳法进一步纯化，除去未完成的较短片段,寡核苷酸片段组装目的基因 用激酶与连接酶组装基因 用聚合酶与限制酶组装基因,化学合成法用途,较短的基因（60-80bp） 用途：PCR引物 测序引物 定点突变 核酸杂交探针,back,体外扩增 通过体外重组和转化，将目的基因在宿主细胞进行扩增 在环境作用下，生物体内相关基因的扩增 进化过程中的基因扩增,基因扩增 gene amplification,2018/10/19,多聚酶链式反应-体外扩增法 （PCR：Polymerase Chain Reaction),Kary B. Mullis,Kary Mullis提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，1993年诺贝尔化学奖,体外 快速扩增 特定基因或DNA序列的方法 优点：模板量少、无需纯化、快速特异、自动化,2018/10/19,1990年 Scientific American 生化学家、冲浪爱好者、情场高手、吸食自制的迷幻药 1972在加州大学柏克莱分校获得博士学位，专业是有机合成 1979年，Mullis离开先前工作的加州大学旧金山分校的医学院，进入Cetus生物技术公司，负责合成寡聚核苷酸，供实验所用 DNA复制反应（加倍），指数函数 1985年12月20日 Randall Saiki PCR应用 发表于Science 12月，Mullis才将论文写好，并投给Nature 1987年初 Methods of Enzymology 1986年5月Mullis在冷泉港举行的“人类分子生物学”专题研讨会中，报告PCR的原理及实际应用结果,