实验实验 Folin-Wu 法定量测定血糖的含量法定量测定血糖的含量一、目的 1、掌握 FolinWu 法测定血糖含量的原理和方法。 2、学会制备无蛋白血滤液。 3、掌握 7200 型可见分光光度计的使用方法。 二、原理二、原理葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与碱性 铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基,Cu2+即被葡萄糖 还原成 Cu+（Cu2O）而沉淀。无蛋白血滤液中的葡萄糖和碱性硫酸铜溶液共热反应, Cu2O 又把 酸性钼酸试剂（Mo6+）还原成低价的蓝色钼化合物钼蓝 。血滤液中葡萄糖的含量与产生的 Cu2O 成正比，而 Cu2O 的量与产 生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。 三、实验仪器三、实验仪器 1、25mL 血糖管3 支； 2、血糖管橡胶塞3 个； 3、1mL 胖肚吸管1 支； 4、100mL 锥形瓶2 个； 5、漏斗架1 个； 6、普通漏斗2 个； 7、水浴锅1 个； 8、电炉1 个； 9、移液管 1mL2 支; 2mL3 支;5 mL2 支;10 mL1 支; 10、滤纸1 盒； 11、吸耳球2 个； 12、7200 型分光光度计1 台; 13、表面皿1 个四、实验试剂、实验试剂 1 1、标准葡萄糖溶液（、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml0.1mg/ml）(1)1%葡萄糖母液：称取 1.000g 葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定 容至 100ml。(2)葡萄糖标准液：取 1.0ml 葡萄糖母液于 100ml 容量瓶中，加蒸 馏水定容。 2 2、10%10%钨酸钠溶液钨酸钠溶液：称取钨酸钠 10g，溶于蒸馏水并定容至 100 毫升。 3 3、0.33mol/LH2SO40.33mol/LH2SO4 溶液溶液：于 53ml 蒸馏水中加入 1ml 的浓硫酸。 4 4、碱性硫酸铜溶液、碱性硫酸铜溶液 A 液：无水碳酸钠 35g，酒石酸钠 13g 及碳酸氢钠 11g 溶 于蒸馏水，稀释定容至 1000ml. B 液：硫酸铜晶体 5g，溶于蒸馏水并定容至 100ml。 临用时，A 液：B 液=9：1 混合（体积比） ，混合液于冰 箱中保存（4） 。 5 5、酸性钼酸盐溶液：、酸性钼酸盐溶液： 称取钼酸钠 600g,用少量蒸馏水溶解后倾入 2000ml 的容量瓶中，加蒸 馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水 0.5ml，摇匀， 静止数小时后取上清夜 500ml，于 1000ml 容量瓶中，徐徐加入 225ml85%磷 酸，边加边摇匀，再加 25%硫酸 150ml。 置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加 99%醋酸 75ml，摇匀， 用蒸馏水稀释定容至 1000ml,贮于棕色瓶中。 五、实验步骤、实验步骤1、无蛋白血滤液的制备： 用奥氏吸管吸取全血（已加抗凝剂）1ml,缓缓放入 100ml 锥形瓶 中，加蒸馏水 7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加 10% 钨酸钠 1ml，摇匀.。 再加 0.33mol/L H2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置 515 分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加 0.33mol/L H2SO41-2 滴） 。 用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液 不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于 1/10ml 全血。2、血糖的定量测定： 取 25ml 的血糖管 3 支，编号。第一支血糖管中加入 2ml 蒸馏水（空白 管） ；第二支血糖管中加 2ml 标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液 2ml，放入第三支血糖管中。 然后向三支血糖管中各加入 2ml 新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于 沸水浴中 8 分钟，取出，在流水中迅速冷却后,勿摇动，各加 4ml 酸性 钼酸盐溶液。 一分钟后，用蒸馏水稀释至 25ml，混匀，用 7200 分光光度计在 420nm 波长处比色，以空白管调节零点。 六、实验结果六、实验结果测量次数/试剂编号123 100000.0760.148 200000.0760.148 300000.0760.148 根据公式 m=A1*C0/A0*1000 得全血中所含血糖质量为 0.01947mg/ml 七、实验分析七、实验分析 实验过程中那些操作可能影响实验结果的准确性？ 答： 1 所取血液的量必需精确.假如由吸管中放出血液的速度太快,会有大量 血液粘在吸管内壁,容量不准,所以普通放出 1ml 血液所用的时间不应少 于 1min. 2.沉淀由鲜红变为暗棕色,是因钨酸钠与硫酸作用生成钨酸,在恰当酸度 时,使血红蛋白变性,沉淀.如血沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊,可 在钨酸与血混合液中参加 10%硫酸 12 滴,待变为暗棕色后再滤. 3加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀,使硫酸和钨酸钠充沛反响，从而完 整沉淀蛋白质。 4.用定量滤纸过滤后应该得到完整廓清无色之无蛋白血滤液。 假如得 到仍带有红色的血滤液则阐明蛋白质未被完整去除。 5. 过滤时应于漏斗上盖一外表皿，避免水分蒸发。 6.热水浴必需严厉控制在八分钟，然后用流水冷却，但制止摇动试管。 7.混匀的时分用大拇指抵住试管口，旋转试管一百八十度，重复若干次。8.所用试管、漏斗均需干燥。 实验中，血糖管有什么作用？ 答： 血糖管与试管的不同之处在于其下粗中间细的构造，可减少一价铜与空 气的接触面积，防止空气将它氧化成二价，使实验数据不准确；若用于吸 抗凝血,则减少血液和吸管壁的接触面积,尽量避免融血. 实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管？ 答： 使其快速冷却，防止在空气中被氧化影响实验结果。常见血糖的测定方法及其分析 血血糖糖的的测测定定方方法法测测定定 方方法法、 、 、 、 、 、 、 、 1 1、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 H H K K、 、 、 2 2、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 G G O O D D 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、F Fo ol l i i n n- -WW u u、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret 法）、Folin酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford 法）。其中 Bradford法和 Lowry 法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏 1020 倍，比 Biuret 法灵敏 100 倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间。五种蛋白质测定方法比较如下：方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法（Kjedahl法）灵敏度低，适用于 0.2 1.0mg 氮，误差为 2费时 810 小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长双缩脲法（Biuret 法）灵敏度低120mg中速 2030 分钟多肽键碱性Cu2仙绾衔硫酸铵；Tris 缓冲液；某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法 较为灵敏50100mg快速 510 分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在 280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正Folin酚试剂法（Lowry 法）灵敏度高5mg慢速 4060双缩脲反应；磷钼酸磷钨酸试剂被 Tyr硫酸铵；Tris 缓冲液；耗费时间长；操作要严格计时；分钟 和 Phe 还原甘氨酸；各种硫醇颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高15mg快速515 分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其 lmax由 465nm 变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS最好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化