资源预览内容
第1页 / 共79页
第2页 / 共79页
第3页 / 共79页
第4页 / 共79页
第5页 / 共79页
第6页 / 共79页
第7页 / 共79页
第8页 / 共79页
第9页 / 共79页
第10页 / 共79页
亲,该文档总共79页,到这儿已超出免费预览范围,如果喜欢就下载吧!
资源描述
第三章 动物细胞工程制药,动物细胞作为一种重要的宿主细胞,可用以下药物的生产: 病毒 疫苗 其他的各种重组蛋白 单克隆抗体,3.1 动物细胞的形态和生理特性 3.2 生产用动物细胞的要求和获得 3.3 动物细胞的培养条件和培养基 3.4 动物细胞培养的基本方法 3.5 动物细胞大规模培养的方法和操作方式 3.6 动物细胞生物反应器 3.7 动物细胞产品制造实例 3.8 动物细胞制药的前景与展望,3.1 动物细胞的形态和生理特性,一、动物细胞的形态离体培养的动物细胞主要为哺乳动物细胞。根据是否需要帖附于支持物上生长的性质,可将动物细胞分为贴壁依赖型和悬浮型两类。1、贴壁依赖型绝大多数细胞在培养时必须贴附在某一固相表面才能生存和生长。按培养细胞的贴壁的形态主要分为4类。,(1)成纤维细胞型形状与体内成纤维细胞形状相似而得名,细胞大致呈梭形或不规则三角形。 (2)上皮细胞型形状为扁平的不规则多角型。 (3)游走细胞型在支持物上分散生长,不连接成片,呈活跃的游走和变形运动。 (4)多形性细胞形态不规则。,2、悬浮型少数细胞在培养时呈悬浮生长,来源于血液、淋巴组织的细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞为悬浮型。形态常为球形,可悬浮培养。3、兼性贴壁细胞不严格的依赖支持物某些情况下可在培养基中良好悬浮生长。,二、动物细胞的生理特征动物细胞培养的一些基本概念:动物细胞体外培养可分为原代培养和传代培养(继代培养)。原代培养是指从机体取出组织或细胞进行初次培养的过程。传代培养是指从原代培养的细胞继续转接培养。原代培养细胞一经传代后便称为细胞系。通过选择或克隆形成法从原代培养细胞或细胞系中获得的具有特异性质或标记的细胞,称为细胞株。不能继续传代或传代次数有限的细胞系或细胞株称为有限细胞系或细胞株。,可连续传代的细胞系或细胞株称为连续细胞系或细胞株。有限细胞系(株)可通过自发、病毒感染、癌基因转移、与其他连续细胞融合等方法转化得到连续细胞系(株)。动物细胞的生理特征:1. 细胞分裂周期长( 1248h ) 2. 细胞生长需贴附基质,存在接触抑制3. 正常二倍体细胞生长寿命有限,二、动物细胞的生理特征4. 对周围环境十分敏感5. 对培养基要求高氨基酸、维生素、无机盐、细胞生长因子、贴壁因子、血清等。6. 对蛋白合成途径和修饰与细菌不同(糖基化)目前,动物细胞和细菌生产的产品,产值约各占一半。,3.2 生产用动物细胞的要求和获得,一、生产用动物细胞的要求原代细胞 二倍体细胞连续细胞腺病毒疫苗和脊髓灰质炎疫苗事故(错用癌细胞)皮下注射癌细胞实验最终产品残留DNA严格限制。,1986年,从淋巴瘤患者分离转化细胞Namalwa细胞,生产干扰素用于临床。猴肾转化细胞Vero生产狂犬疫苗和脊髓灰质炎疫苗被批准大量用于人群。1987年,杂交瘤细胞生产OKT3单抗用于临床排异反应。1988年后,大批异倍体传代细胞生产的重组蛋白被批准上市。最终产品残留DNA严格限制。,二、生产用动物细胞的获得1 .原代细胞直接取自动物组织、器官,经粉碎、消化得到的细胞悬液。需要大量动物。鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、血液淋巴细胞。2. 二倍体细胞系通过筛选、克隆从原代培养细胞中获得的具有某种特征的有限细胞株有限增殖、2n、贴壁、接触抑制MRC-5、WI-38,MRC-5:1966年,14周正常男性胎肺组织中获得2n=46寿命4246代用于人用疫苗的生产3、转化细胞系通过某个转化过程形成, 常由于染色体断裂成为异倍体。自发形成,啮齿动物细胞多发;病毒感染后转化;直接从动物肿瘤组织中建立的细胞系。转化细胞具有无限生命力,一般倍增时间短、对培养条件和生长因子要求较低。,CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、COS、BHK-21、Namalwa、Vero细胞等。COS细胞(非洲绿猴肾细胞):1981年,Gluzman用复制起点缺失的SV40(猿猴空泡病毒40)转化非洲绿猴肾细胞CV-1,获得3个细胞系:COS-1、 COS-3 、 COS-7。COS细胞组成性表达SV40大T抗原,带有SV40 ori复制子的质粒以附加体的形式高拷贝扩增(105 拷贝)大量扩增质粒及高表达mRNA、蛋白质,易回收和分析易培养、易转染。,CHO-K1细胞:1957年,Puck等从中国仓鼠卵巢分离,上皮样细胞。CHO-dhfr- 为二氢叶酸还原酶突变型(培养时需加入次黄嘌呤、胸苷),用于工程细胞构建。,4、融合细胞系细胞融合:两个或两个细胞合并成一个细胞的过程。主要为杂交瘤细胞。细胞自发融合的频率很低,需要采用人工的方式进行细胞融合,方法有3种:生物方法(病毒)、化学方法(PEG)、物理方法(电融合)目前,常用的为PEG和电融合。,(1)病毒诱导融合可促进细胞融合的病毒有:疱症病毒、天花病毒、副流感病毒、副黏液病毒等。仙台病毒为副黏液病毒的一种,对人危害小而且有效,使用最广。起融合作用的为病毒被膜上的糖蛋白。细胞融合时加入灭活的仙台病毒,两个细胞在病毒的黏结作用下靠近,通过病毒与细胞膜的作用使两个细胞膜相互融合。细胞融合率较低,而且还需病毒,现已很少使用。,(2)PEG融合诱导融合的机理还不明确。PEG(聚乙二醇)为乙二醇的线性多聚体,结构式为H(OCH2CH2)nOH ,分子量1000以上为固体,1000以下为液体。用于细胞融合的PEG分子量一般为10006000,浓度为3050%。融合效率最高可达10% 。3、电融合细胞在强电场脉冲的作用下,细胞膜上会短暂出现小孔,如果两个细胞贴近,电脉冲时紧贴的质膜会瞬时破裂而导致膜的融合,从而形成杂合细胞。优点:融合率很高、对细胞毒性低、适合各种细胞、可用于细胞数量很少的融合过程。,细胞融合需要经细胞膜融合、细胞质渗透、细胞核融合等主要步骤。,5、重组工程细胞系构建含目的基因的真核细胞表达载体(病毒载体、质粒载体) 导入动物细胞 通过选择标记筛选工程细胞瞬时表达稳定表达生产上为了获得高效稳定表达的工程细胞株。,哺乳动物表达系统(载体、筛选标记等)详细内容可参考: 基因工程楼士林(厦门大学)主编,科学出版社,2002,三、细胞库的建立除原代细胞,其他细胞系或株需要建库保存。原始细胞库(master cell bank,MCB)二倍体细胞:群体倍增水平尽可能低的细胞(传代次数尽可能少的细胞)记录详细档案工作细胞库(working cell bank,WCB)生产用细胞库(manufacturers working cell bank,MWCB),生产,3.3 动物细胞的培养条件和培养基,一、动物细胞的培养条件1、器材的清洗新的玻璃: 泡酸(5%盐酸 12h)、刷洗、清洁液泡12h(重铬酸钾-硫酸洗液)、冲洗2、水质新鲜的超纯水、双蒸水或三蒸水无热原,3、pH值 最适pH为7.27.4,低于6.8或高于7.6对细胞生长不利酚红细胞代谢产乳酸Na2HPO4/NaH2PO4 、NaHCO3/ CO2 HEPES(pKa 7.6) 1050mMMOPS、DIPSO等。4、渗透压理想的渗透压可保持在290300 mOsm(milli - osmol )/kg,可通过增减NaCl的量调节。1mg/ml NaCl 32 mOsm/kg,平衡盐溶液(balanced salt solution,BSS) 维持渗透压、pH,5、温度 哺乳动物细胞的最佳培养温度为370.5,可在2535生存和生长, 40以上只能存活几十分钟到几个小时。6、氧气和二氧化碳二氧化碳主要调节培养基的pH值,二氧化碳的比例可为35% ;氧气影响细胞生长,溶氧过高对细胞产生毒害,过低抑制细胞生长。可采用不同比例的氧气、氮气、二氧化碳和空气加以调节。,7、抗生素 防止微生物污染可在培养基中加入一定量的抗生素。生产中不准使用青霉素和-内酰胺类抗生素。,8、器材的消毒灭菌 物理方法:湿热、干热、紫外线、伽马射线、过滤。化学方法:化学消毒剂,主要用于空气、表面灭菌消毒、污染物品处理。,二、动物细胞培养基不同的动物细胞对培养基的要求差异很大,一般无规律可循,常需要花费很大的时间和精力确定适合的特定细胞需要的培养基。动物细胞培养基按组成大致可分为三类: 天然培养基包括血清、淋巴液、胚胎浸取液等。成分复杂、组分不稳定、来源有限。补充血清的合成培养基在一些合成培养基中添加520%血清而成。最常用的血清为小牛血清、胎牛血清,还有马血清等。,合成培养基成分明确、组分稳定,目前商品化的有几十种(如MEM、DMEM、RPMI1640、199等),主要由成分包括:氨基酸 必需氨基酸、半胱氨酸、酪氨酸及其他种类氨基酸; 维生素 能源物质(葡萄糖、谷氨酰胺) 无机盐 缓冲体系 其他成分 如核酸前体物质(腺苷、鸟苷等)、脂类物质等,血清的作用:提供细胞生长所需的各种生长因子和激素提供细胞生长所需的贴附因子和伸展因子提供可识别金属离子、激素、维生素、脂质的结合蛋白提供细胞生长所必须的脂肪酸和微量元素。,含血清培养基的缺点:血清的来源和批次不同导致培养差异血清的保存期有限血清很容易污染杂菌血清可能含病毒和支原体血清本身所含蛋白增加了产品的分离纯化难度血清供应问题成本高,无血清的培养基在合成培养基中添加一些特殊成分而成: 激素和生长因子 (胰岛素和表皮生长因子等)结合蛋白(铁传递蛋白、白蛋白)帖附和伸展因子(纤维结合蛋白胶原、一些多肽)其他有利于细胞生长的因子和元素(谷胱甘肽、硒等)无血清培养基的优点:提高了细胞培养的重现性、减少了血清带来的污染问题、供应充足、产品易于纯化。,3.4 动物细胞培养的基本方法,一、动物细胞的生长过程大多数动物细胞为贴壁细胞,培养细胞的生长过程通常包括5个时期: 1、游离期又称悬浮期,细胞接种后在培养液为悬浮状态,细胞为球形。10min4h。 2、贴壁期细胞附着在固体表面,在培养开始后10min4h 贴壁。细胞贴壁需要特殊的表面或其他物质,如胶原、玻璃、塑料等。血清中含有促进细胞贴壁的球蛋白、胶原、纤黏素等糖蛋白(促贴壁因子),这些蛋白带正电荷,先吸附于固体表面,细胞再吸附在这些促贴壁因子表面。,3、潜伏期细胞有生长活动,但无细胞分裂。6h24h。 4、对数生长期细胞活力最高,生长速度最快。 5、停止期(平台期)固体表面长满细胞,细胞虽有活力但不再分裂。,二、动物细胞培养的基本方法1、细胞分离 (1)离心分离从含有细胞体液中分离低速离心(8001000rmp, 510min)(2)消化分离组织块剪碎消化液消化细胞悬液洗涤细胞消化液:胰蛋白酶、EDTA、胰酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA、胶原酶等。,2、细胞计数(1)自动细胞计数器计数无法区分死活细胞无法区分单个细胞和细胞团(2)血球计数板计数采用台盼蓝或苯胺黑染色后计数可区分死活细胞。(3)结晶紫染色细胞核计数法结晶紫染色液(结晶紫+ 柠檬酸)能使细胞分离破碎,细胞核染成蓝色,在血球计数板计数细胞核即得细胞数。(4)MTT(四甲基偶唑盐)染色计数MTT(淡黄)被活细胞线粒体脱氢酶转变为不溶的甲月替(formazan,紫色),溶于脱色液,比色从标准曲线得细胞数。,3、细胞传代(1)悬浮细胞稀释传代(2)贴壁细胞消化液(胰酶)消化倒去消化液加入含血清的培养基传代,4、细胞的冻存和复苏 (1)冻存液氮(-196 )保存冻存时细胞状态良好密度1106 2 106 /ml加10%DMSO(二甲基亚砜)或甘油降温速度 1 /min(2)复苏快融从液氮罐中取出立即放入3740 水浴中。离心换液或解冻后直接加培养基培养,46h贴壁后立即换液。,3.5 动物细胞大规模培养的方法和操作方式,一、动物细胞大规模的培养方法分为悬浮培养、贴壁培养、假悬浮培养(微载体培养、微囊化培养)等。 1、悬浮培养适用于非贴壁依赖性细胞,如杂交瘤细胞。适应于兼性贴壁细胞。Wellcome公司 8000L搅拌罐生物反应器培养Namalwa细胞产干扰素。Celltech公司2000L气升式生物反应器培养杂交瘤细胞产单抗。,
网站客服QQ:2055934822
金锄头文库版权所有
经营许可证:蜀ICP备13022795号 | 川公网安备 51140202000112号