2018/10/21,蛋白质的纯化,报告人：,纯化策略,确定研究目标：要获得什么样的蛋白质？ 理化性质 生物活性,重点注意问题保证活性 减少不必要的纯化步骤 合理组织纯化步骤,蛋白质的分离纯化方法,沉淀法 根据分子大小不同：超滤法、透析法（膜分离法）、 凝胶过滤法（GF）、超速离心法等。 根据分子所带电荷差异：离子交换层析法(IEX)、电泳法、等电聚焦等。 根据疏水性不同：疏水层析(HIC)、反相色谱(RPC) 亲和层析(AC),沉淀法,原理：是使蛋白质胶体颗粒的表面水化膜或表面电荷破坏，从而使蛋白质沉淀。,盐析法 有机溶剂沉淀法 等点电沉淀法 选择性变性沉淀法 聚合物沉淀法,在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： 中性盐沉淀（盐析法）：最大的特点是环境温和，不易造成蛋白质变性。因此适用于各种蛋白质和酶的分离纯化。缺点是分辨率底，且后续处理时需要除盐。 有机溶剂沉淀：分辨率高于盐析法，但容易引起目的蛋白失活。所以多用于生物小分子的分离纯化比如多肽、寡肽。 等电点沉淀：其局限是，须事先了解蛋白的PI；且沉淀过程中可能发生变性和失活，部分蛋白等电点沉淀后不容易溶解，因此较少用于目的蛋白的沉淀。用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。三氯乙酸是比较常用的酸变性剂，尤其在分析样品的浓缩而不需考虑活性的条件下用得多。 有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇作为沉淀剂，常用PEG6000和20000。它条件温和，不易变性，且沉淀效果强，很少量的PEG可沉淀大量的蛋白。缺点是PEG除去比较困难。,有机溶剂沉淀,原理 F= ，有机试剂有较低的介电常数e； 水合作用，破坏水化膜。,操作注意事项,冰浴 缓加 温和搅拌,色谱技术,色谱技术应用概况,色谱联用策略,不同色谱技术由于原理不同适用于不同的起始条件； 应尽可能将不同的色谱技术联合起来，以减少中间环节： 理想的情况是：前一柱洗脱液条件等同于后一柱的起始条件。,起始条件 色谱技术 结束条件 小样品体积 样品被稀释缓冲溶液被交换 低离子强度 PH改变或高离子强度 高离子强度 低离子强度 特定的结合条件 特定的洗脱条件,色谱联用流程,IEX HIC GF AC GF RPCIEX HIC GFAC GF (NH4)2SO4 HIC IEX GFHIC GFIEX GF GF（脱盐） AC GF,各种色谱介绍,凝胶过滤层析 也称大小排阻层析，是一种根据分子的大小和形状来进行分离的方法。不同的蛋白质分子通过凝胶微孔时因迁移能力不同而被分离。 利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，（在其分离范围内）按分子大小将样品中各组份分离开来。大分子先被洗脱，小分子后被洗脱。,应用 脱盐 Sephadex G10、25 缓冲溶液交换 中间纯化 Sephadex G200 精纯 Sephacryl 、Superdex,常用填料,Sephadex系：是以氯代环氧丙烷进行交联的葡聚糖珠状凝胶。 经典的凝胶介质 Sepharose系:经过纯化的琼脂糖，含极少的带电集团。 型号最多、应用最广 Sephacryl系：有是丙基葡聚糖与N,N-亚甲基双丙稀酰胺共聚而成。 经济高效 Superdex系：是葡聚糖与琼脂糖共聚而成的复合凝胶。 最新，选择性强，分辨率极高,建议流速2039cm/h,建议流速3060cm/h,层析条件的选择,凝胶介质：分离范围、分辨率。微粒越小，柱效越高，峰形越狭窄，分离度越高。 流速：孔径较小较结实的填料，耐受的流速要高于孔径大的填料。 上样：上样量；样品浓度PI，但不能高于介质功能基团的PK； 阳离子交换层析：蛋白质带正电荷，则要求PHPI，但不能低于介质功能基团的PK； 缓冲溶液： 阴离子交换层析：Tris-HCl 阳离子交换层析：PB 上样：上样量；盐浓度,吸附速度： 洗脱方式：改变离子强度、PH 等梯度洗脱 阶段洗脱 梯度洗脱 洗脱速度：阶段洗脱可尽量大；梯度洗脱需根据出峰情况调整。,离子交换剂的选择,考虑因素： 酸碱强弱：由功能基团决定 稳定性 再生性 经济,离子交换剂的选择,常见类型,纤维素类：无定形，分辨率和稳定性都较低 葡聚糖系：体积和流速受PH值、离子强度影响较大； 琼脂糖系：最常用 聚乙烯醇系(Toyopearl)：全合成的 苯乙烯系（Source）：流速快，分辨率高,常见问题分析,不吸附：缓冲溶液PH不对；离子强度太高； 峰形不稳或出现奇异峰：柱床中有气泡或缓冲溶液不纯 分辨率低：梯度太大；流速太高 前沿峰：柱过载；填充效果差；柱需再生 峰拖尾：样品在柱滤膜上或凝胶床顶部沉淀 基线随梯度上移：盐浓度临近CMC,疏水层析,“盐促吸附层析” 在适当高盐浓度下，蛋白质的疏水残基与固定相上的疏水配基产生吸附作用。,特点：它分离效率高，上样量大，特别适合分离盐析沉淀的样品。 填料：烷基琼脂糖凝胶、苯基琼脂糖凝胶，丁基琼脂糖凝胶，辛基琼脂糖凝胶等。,反相色谱,原理：是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子迁移速度快而先被洗脱下来。 一般使用甲醇、乙腈作流动相，使得蛋白质容易变性失活； 常用于HPLC分析，与在水-有机相中稳定的多肽和低分子量蛋白质的分离。,疏水层析VS反相色谱,同：分离介质（固定相）吸附原理 异：作用强弱用途,亲和色谱,是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术 。例如，抗原抗体、酶底物或抑制剂、激素受体、糖蛋白凝聚素等等。 目的蛋白纯品 制备抗体 偶联到基质上 层析分离,常用分析与检测技术,含量测定：凯氏定氮法、UV、Lowry法、BCA法、Bradford法等 分子量测定：电泳、凝胶过滤 PI测定 ：等电聚焦电泳,The end,Thank you!,