1,-Company name,实时荧光定量PCR技术 原理、应用及实践,(Real time Quantitative PCR),北京康为世纪生物科技有限公司,Real time Quantitative PCR,2,-Company name,2,北京康为世纪生物科技有限公司,康为的目标：成为中国的Invitrogen,您的问题解决专家！,3,-Company name,3,北京康为世纪生物科技有限公司,核酸提取 PCR、RT-PCR 及荧光定量PCR DNA 分子量标准 克隆与转化,蛋白质 学相关,蛋白提取与纯化 蛋白定量、蛋白Marker及蛋白电泳产品 Western Blot产品,免疫学相关,免疫组化产品、免疫沉淀 标签抗体 内参抗体 二抗,完善的产品线,4,-Company name,4,五大平台 一站式服务,5,-Company name,5,园区公共服务平台,2010年康为世纪公司依托江苏省泰州市政府及中国医药城的支持政策，成立江苏康为世纪，主要进行创新的临床诊断试剂的研发、生产与相应的技术服务， 占地面积约3300平米 2700平米的实验区: 临床生化诊断试剂研发平台 免疫诊断试剂研发平台 分子诊断试剂研发平台 免疫组化诊断试剂研发平台 约300平米GMP标准的生产车间,总投资6500万元,泰州国家生物产业基地临床诊断试剂研发与生产公共服务平台,6,-Company name,6,荧光定量PCR仪,芯片点样仪,芯片扫描仪,全自动核酸提取仪,超速离心机,焦磷酸DNA测序仪,分子生物学平台,凝胶成像仪,泰州国家生物产业基地临床诊断试剂研发与生产公共服务平台,芯片杂交仪,7,-Company name,康为世纪生物科技有限公司,7,分子生物学全系列产品蛋白质学产品免疫学相关产品,北京康为世纪生物科技有限公司,我们的客户,我们的合作伙伴,北京大学、清华大学、复旦大学等 中国科学院协和医院、上海瑞金、军事医学科学院 301医院、医院 华大基因、诺华制药 九强、博奥等,8,-Company name,用我们的产品发表的部分SCI文章,a-Bisabolol induces dose-and time-dependent apoptosis in HepG2 cells via a Fas-and mitochondrial-related pathway,involves p53 and NFkB State Key Laboratory of Virology, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, China CCR4-NOT Deadenylates mRNA Associated with RNA-Induced Silencing Complexes in Human CellsState Key Laboratory of Molecular Biology and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China Coadministration of huperzine A and ligustrazine phosphate effectively reverses scopolamine-induce damnesia in ratsSchool of Pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, PRChina Effects of Microgravity Modeled by Large Gradient High Magnetic Field on the Osteogenic Initiation of Human Mesenchymal Stem Cells CCR4-NOT deadenylates RISC-associated mRNA in human cells State Key Laboratory of Molecular Biology, Institute of Biochemistry and Cell Biology Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Science shanghai,china,9,-Company name,主要内容,Company name,Real-time qPCR的定量原理,2,Real-time qPCR的检测方法,3,Real-time qPCR的基本概念,1,Real-time qPCR的解析方法,4,10,-Company name,PCR：伟大的天才发明,Use of LSDSynthesis and self-testing of novel psychoactive substancesBelief in astrology,11,-Company name,PCR：基本原理,Denaturation: 94 96C,Annealing: 50 65C,Extension: 70 75C,基本要素：TemplatePrimersDNA polymerasedNTP, N=A,G,C or T,12,-Company name,PCR：基本原理,Company name,理想的PCR反应：N=N0*2n实际的PCR反应：N=N0* (1+E)nN0：初始模板量 N：第n次循环后的产物量 n：扩增反应的循环次数E：扩增效率,S形曲线，具有平台效应,13,-Company name,Company name,与普通PCR的对比,同一个样本进行96次重复,传统PCR检测,Real time PCR 检测,Real time PCR-起点检测： - 起点量是样本中起始的DNA量 - “加入了500个拷贝” - 具有重现性，误差小,传统PCR-终点检测： - 终点产物量经过PCR放大的DNA量 - “生成了500，0000，0000个拷贝” - 不恒定，误差大,传统PCR检测,14,-Company name,Real-time qPCR,激发光,发射光,- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 - 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 - 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。,荧光基团,15,-Company name,扩增曲线（primary curve）,Company name,扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）,线性图,对数图,16,-Company name,Company name,荧光阈值（threshold）,基线(baseline)：一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信号 荧光阀值(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值 - 缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍 - 手动设置：大于样本的荧光背景值,17,-Company name,Ct 值(Cycle Threshold),themegallery,Company name,Ct值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，荧光值所对应的PCR循环次数。起始模板量 基线 阈值 Ct值,18,-Company name,Ct 值(Cycle Threshold),themegallery,Company name,Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动很大，但Ct值相对固定； Ct值则极具重现性,19,-Company name,Ct值可以确定初始模板量？,Rn=RB+ X0 (1+E)N * RS 第n个循环的总信号=本底信号 + 起始DNA数目 * PCR扩增效率 * 单位信号强度当循环次数n=Ct时 RCt=RB+ X0 (1+E)Ct * RS 两边同时取对数得: lg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRS Ct=-lgX0/lg(1+E)+ lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E)Ct=-klgX0+b,Company name,lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。,20,-Company name,Company name,Rn vs. Cycle number- 扩增曲线,LogDNA vs. Ct - 标准曲线,标准曲线 (standard curve),标准曲线分析 - 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释,21,-Company name,