第十章 甾体激素类药物的分析 The Analysis of Steroid Hormon Drug,张蕾 中药分析教研室,基本结构：环戊烷骈多氢菲,第一节 基本结构和分类,一、母核,环上双键的表示方法：双键位置,4,1,4,5,5(10),二、分类：,甾体激素,肾上腺皮质激素,性激素,雄性激素及蛋白同化激素,孕激素,雌激素,1肾上腺皮质激素,皮质酮的衍生物,4-3-酮基：UV、与羰基试剂反应,C17位有-酮醇基：还原性,11,C11位有-OH或=O,母核含有21个C,代表药物：,可的松,氢化可的松,人工合成药物：,地塞米松 氢化可的松结构的基础上1，2位间引入一个双键，9位上引入-F，16位上引入-CH3,在氢化可的松结构的基础上1，2位间引入一个双键,1,2,氢化泼尼松,1,2,9,16,结构特点： 含有21个C A环：4-3-酮结构（,-不饱和酮） 17位：-醇酮基，有还原性。人工合成品：1、2位间有双键，6位，9位引入卤素，16位或16位引入甲基，16位引入羟基等。,2雄性激素及蛋白同化激素,睾丸素的衍生物,结构特点： (1)母核含有19个C (2)A环的4-3-酮 (3)17位羟基甲基酯,蛋白同化激素在C10位上一般无角甲基,代表药物：,甲基睾丸素,丙酸睾丸素,苯丙酸诺龙,3孕激素,黄体酮,结构特点： (1)含有21个C (2)A环的4-3-酮 (3)17位甲酮基,与亚硝基铁氰化钠反应,4雌激素雌二醇、炔雌醇及衍生物,炔雌醇,雌二醇,雌酮,(1)母核含有18个C (2)A环：苯环，3位Ar-OH10位无甲基 (3)17位：羟基、乙炔基,结构特点：,口服避孕药,炔诺酮,异炔诺酮,安宫黄体酮,小结,第二节 鉴别试验,一、化学鉴别法,(一)母核反应,如：,(二)官能团的反应,1、C17 醇酮基,强还原性,TTC氯化三苯四氮唑(又叫红四氮唑RT) BT蓝四氮唑,呈色反应,C3酮基和C20酮基:,常用的羰基试剂： 2,4-二硝基苯肼, 异烟肼, 硫酸苯肼, 氨基脲, 苯肼,异烟腙（黄色）,黄体酮,异烟双腙（黄色）,3. 甲酮基,孕激素特征反应。,活泼次甲基反应（Zimmermann 反应）,羰基邻位的次甲基叫活泼次甲基。,羰 基 C3、C11、C20 次甲基 C2、C12、C21,羰 基 C17 次甲基 C16,可的松,雌酮,2,12,21,17,16,4. 酚羟基,5. 乙炔基,有机氟,F,有机破坏,有机氯,Cl,6. 有机卤素,茜素氟蓝硝酸亚铈,HNO3AgNO3,AgCl,呈色,茜素氟蓝,蓝紫色,F-,香,7. 水解产物的反应,特臭,特臭,（二）制备衍生物测定熔点,（三）紫外分光光度法,（四）红外光谱法（特征性强）,中国药典上收载的甾体激素类药物均有红外光谱图。,（五）薄层色谱法,（六）HPLC,第三节 特殊杂质检查,有关物质、硒、残留溶剂、游离磷酸盐,（一）有关物质,1、来源: 原料,中间体,异构体,降解产物,2、方法:（具有一定分离能力）TLC法（高低浓度对比法）HPLC法（类似高低浓度对比法）,（1）TLC法（高低浓度对比法）,判定方法：规定杂质斑点数目规定杂质斑点颜色,（2）HPLC法（高低浓度对比法）,判定方法：规定杂质峰数目规定杂质峰面积,醋酸氟轻松 检查 其他甾体,取本品加氯仿-甲醇(9 : 1)制成3.0mg/ml作为供试液，精密量取适量，加氯仿-甲醇(9 : 1)稀释成0.06mg/ml作为对照液；照薄层色谱法，各取5l，分别点于同一硅胶G板上，以氯仿-甲醇（97 : 3）为展开剂，展开后晾干，在105干燥10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视，供试品溶液如显杂质斑点，不得多于2个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。,1,2,取本品适量，精密称定，以无水乙醇为溶剂，配制成每1ml含2mg的溶液（1）与每1ml含0.04mg的溶液（2），用含量测定项下的方法和溶液(0.16mg/ml)，取10l注入液相色谱仪，调整仪器灵敏度，使主成分峰高度达记录仪的满量程。再分别取溶液（1）和溶液（2）各10l，进样。记录至主成分峰保留时间的2倍。溶液（1）显示的杂质峰数不得超过4个，各杂质峰面积及其总和分别不得大于溶液（2）主峰面积的1/2和3/4。,醋酸甲地孕酮 检查 其他甾体,二、硒,1、来源：合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢,剧毒,2、原理,3、方法,对照品溶液的制备：精密量取标准砷溶液（每1mL相当于1g的Se）5mL, 置100mL烧杯中，加硝酸溶液(130) 25mL和水10mL,即得。 供试品溶液的制备：取本品50mg，照氧瓶燃烧法进行破坏后，将吸收液转移至100ml烧杯中，用水15ml冲洗燃烧瓶及铂丝，并入吸收液中，即得。 检查法：将上述硒对照品溶液和供试品溶液分别用氨试液调节pH值至2.00.2后，转移至分液漏斗中，用水少量分次洗涤烧杯，洗液并入分液漏斗中，使成60ml，各加盐酸羟胺溶液（12）1ml，摇匀后，立即精密加二氨基奈试液5ml，摇匀，在室温下放置100分钟，精密加环己烷5ml，强烈振摇2，静置分层，取环己烷脱水后，测A378nm。规定 A供A对。,醋酸氟轻松 检查 硒,三、有机溶剂残留（甲醇和丙酮）,甲醇：0.3%,丙酮：0.5%（g/g),GC法,地塞米松磷酸钠,检查 甲醇和丙酮,精密称取本品0.16g，置10 ml量瓶中，精密加内标溶液2ml，加水稀释至刻度，作为供试液；另精密量取甲醇10l(7.9mg)与丙酮100l (79mg)置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，精密量取1mL，置10mL量瓶中，精密加内标溶液2ml, 加水至刻度，作为对照液。取对照品溶液和供试品溶液，照残留溶剂测定法测定，应符合规定。,四、游离磷酸,对照品法,1、原理：,地塞米松磷酸钠 氢化可的松磷酸钠 倍他米松磷酸钠 氢化泼尼松磷酸钠,检查 游离磷酸,地塞米松磷酸钠,精密称取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml溶解，精密加钼酸铵硫酸试液2.5ml与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1ml，加水至刻度，摇匀，在20放置3050分钟，照分光光度法，在740nm处测定吸收度，与对照液4.0ml同法处理的吸收度比较，不得更大。,（对照液 0.0035%KH2PO4）,（对照液 0.0035%KH2PO4）,第四节 含量测定,一、HPLC, USP、BP、JP均采用, RPHPLC（大多内标法）,（甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰）,特点:用样量少，灵敏度高，分离效果好,黄体酮注射液的含量测定,取本品适量,乙醚,50mL量瓶,精密量取,5.0mL,挥散乙醚,残渣,甲醇,振荡提取10 min/次/4 次,离心,上清液,内标溶液,5.0 mL,甲醇,25mL 量瓶,供试品溶液的制备,对照品溶液的制备,15 min,黄体酮约25mg,甲醇,25mL量瓶,精密量取,5.0mL,内标溶液,5.0 mL,25mL 量瓶,测定与计算,供试品溶液 5 L,对照品溶液 5 L,HPLC,Ai供，As供,Ai对，As对,（1）专属性 “干扰”,方法学验证,对照品色谱图,阴性对照溶液色谱图,缺黄体酮的模拟注射液,供试品溶液的制备(不加内标),阴性对照溶液,供试品溶液色谱图,（2）仪器精密度,（3）方法重复性,仪器稳定性（同一溶液6次测定的RSD）,供试品制备工艺的稳定性 （同一工艺下平行制备6份供试液测定值的RSD）,（4）标准曲线及线性范围,X：Ci（黄体酮）,y：Ai/As（待测物与内标物的峰面积比值）,（5）回收率试验,方法的准确度,发现量与加入量的接近程度,R = 发现量/加入量1,（6）耐受性,二、UV法,-3-酮 240nm (),肾上腺皮质激素 雄性激素和蛋白同化激素 孕激素,苯环 280nm (),雌激素, 适用于原料药。 样品中“其它甾体”不合格时，不适用。,三、 比色法,（一）异烟肼比色法,（二）四氮唑比色法,（三）kober反应比色法, 对照品比较法,（一）异烟肼比色法,1原理C3酮基及某些其他位置上的酮基能与羰基试剂异烟肼在酸性条件下形成黄色异烟腙，在一定波长下具有最大吸收，可用于定量,2、反应条件,（1）溶剂：无水乙醇，无水甲醇,（2）酸的种类、浓度及异烟肼的浓度常用HClHCl：异烟肼 = 2M:1M时，获最大吸收度。,（3）水分、O2、光线的影响,含水量腙水解A%,O2与光线无影响,（4）反应的专属性反应条件下，4-3-酮具有一定专属性C20酮基反应慢，C17酮基反应慢；C11酮基不反应 4-3-酮室温下，不到1h反应完全,倍他米松磷酸钠的含量测定,取本品适量,= 420 nm,50mL量瓶,精密量取,1.0mL,异烟肼溶液20 mL,60水浴, 1 h,甲醇,25 mL量瓶,供试液：,对照液：,取倍他米松磷酸钠适量,摇匀,冷却,甲醇,Ai,肾上腺皮质激素类,C17-醇酮基,强还原性,1、原理,（二）四氮唑比色法,（1）红四氮唑（缩写TTC 或RT）,2、四氮唑盐的种类：,（2）蓝四氮唑：,BP； ChP,USP,不溶于水的 三苯甲瓒深红,蓝四氮唑（BT）,双甲瓒（暗蓝）,4、讨论结构、反应温度和时间、水分、碱浓度、空气中氧、试剂类别和浓度等，对反应速度，呈色强度和稳定性有影响。,（1）官能团位置的影响, C11: V11C=O V11C-OH可的松氢化可的松,B：V简单酯V复杂酯 醋酸酯磷酸酯琥珀酸酯三甲基醋酸酯,（1）官能团位置的影响, C21：-羟基（C21-OH）,A: 21-OH酯化后较母体羟基反应速度慢即：V游离体V酯类如：可的松醋酸可的松,（2）溶剂、水分的影响,含水量5%,含水10%A10% 含水30%几无反应,无水乙醇,采用氢氧化四甲基铵能得到满意结果。,（3）碱的种类及加入顺序的影响,加入顺序：先加TTC或BT，后加(CH3)4N+OH-,原因： 皮质激素与(CH3)4N+OH-长时间接触，有部分分解。,（4） O2与光线的影响,反应过程 反应产物,O2影响颜色强度和稳定性,隔绝空气充N2 快速,（5） 温度与时间,t甲瓒分解%,1.原理,max=515,雌激素,（三）Kober反应比色法,雌激素类药物的特征反应,雌二醇-3-甲醚,max=465,max=515,2、Kober反应缺点：,（1）条件较难控制，易出双色黄+红,（2）重现性较差：,呈色强度和稳定性受试剂浓度、组成、反应时间和温度的影响。,甾体激素提取物中其他物质及制剂中稳定剂，赋形剂,溶剂对测定有干扰,为克服这些缺点，对Kober反应所用试剂进行改进铁酚试剂法,（四）铁酚试剂法,1、铁酚试剂的组成：硫酸亚铁铵、浓硫酸过氧化氢、苯酚,2、各试剂的作用, Con.H2SO4和H2O2的作用,即：Fe2+Fe3+,三价铁的作用,2、各试剂的作用,加快黄色生成的速度 促进黄色向红色的转变 增加红色的稳定性,苯酚的作用,消除反应产生的荧光 促进红色的生成,1、熟悉本类药物的分类，掌握其结构特征与分析方法的关系； 2、掌握某些官能团的呈色反应，了解其他鉴别方法； 3、掌握本类药物中其他甾体的检查方法，了解其他特殊杂质的检查,第十一章 复习内容,4、掌握各种比色法的原理、方法及测定条件。了解UV法和HPLC法在其含量测定中的应用。,