现代微生物发酵及技术教程,4.微生物发酵工程概述,2,4.微生物发酵工程概述,3,发酵工程是利用微生物细胞的代谢过程生产有用的各种产物的过程，它由三个核心部分组成：一、生产特定产物的微生物菌种的选育；二、利用适当的设备和技术为菌种提供最佳条件，充分发挥菌种的生产能力；三、将发酵产生的产物经分离、纯化，以提高收率获得质量合格的产品。微生物发酵工业以发酵为主，发酵水平的好坏是整个生产的关键，但后处理在发酵生产中也占有重要的地位。完整的微生物发酵工程应该包括从原料到获得终产品的过程，即菌种是基础，发酵是关键，分离纯化是保障。,4,4.1 微生物发酵的类型,按照微生物对氧气的要求、发酵采用的方式、发酵产物的特性，将发酵分为不同的类型： 4.1.1 按照微生物对氧气的要求分类 1、好氧发酵：指发酵产物形成时需要充足的氧气。如柠檬酸发酵、草酸发酵、谷氨酸发酵以及各种抗生素发酵等。 2、厌氧发酵：指发酵时不需要提供氧气，如丙酮-丁醇发酵、乳酸发酵、丙酸发酵、丁酸发酵等。 3、兼性厌氧发酵：产生酒精的酵母菌是一种兼性厌氧微生物，在缺氧条件下进行酒精发酵，积累酒精，在大量通气条件下则进行好氧发酵，产生大量酵母细胞。,5,4.1.2 按微生物发酵采用的培养基状态分类,1、固体发酵固态发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度下的固态基质中，用一种或多种微生物的一个生物反应过程。,6,固体发酵的优点：操作简便、发酵过程容易控制、对无菌要求相对较低、不易发生大面积的污染；基质含水量低，生物反应器的体积小；发酵的副产物可以综合利用，不需废水处理；供氧由气体扩散或间接通风完成，能耗低；能在一定程度上解除产物抑制，可获得较高的次级代谢产物。,7,缺点：厂房面积大；生物反应器设计不够完善；难以准确测定含水量、菌体量和二氧化碳生成量等发酵参数；微生物生长速度缓慢，容易污染；只适合用于耐低活性水的菌等的发酵。,8,2.液体发酵,液体发酵的方式：1、将培养基放在瓷盘内，进行静止培养，称浅盘发酵（表面发酵）。该法存在不少的缺点，如劳动强度大，占地面积大，产量小，易染杂菌等，因此迅速被液体深层发酵所取代。2、将培养液放入不锈钢制成的发酵罐，在罐内进行深层发酵。,9,液体深层发酵的优点： 1、液体为悬浮状态为许多微生物提供最适合生长环境，菌体生长快，发酵产率高，发酵周期短；2、在液体中，菌体、底物、产物以及发酵产生的热量易于扩散，使发酵可在均质条件下进行，易于控制，便于扩大生产规模；3、厂房面积小，生产效率高，易进行自动控制，产品质量稳定；4、产品易于提取和精制。但液体深层发酵消耗能源多，设备复杂，需要较大的投资，有废物排除等缺点。,10,4.1.3 发酵的一般工艺过程,微生物发酵产物虽然多种多样，发酵类型不一，但总体上的工艺流程是相似的，包括以下过程：1、原料的处理和灭菌；2、空气的净化除菌；3、菌种的扩大培养；4、发酵的条件控制；5、产品的提取精制等阶段。,11,4.2 原料的选择及处理,培养基是微生物生长繁殖需要的营养环境。培养基成分包括碳源、氮源、无机盐、微量元素和水等。 4.2.1 选择合适的原料 标准： 1、原料中碳的可利用率高； 2、发酵率高，而且尽可能使发酵残余物少； 3、原料质量好，成分稳定，污染变质少，易灭菌； 4、廉价，来源方便，易于保藏。,12,4.2.2 淀粉水解糖的制备,淀粉是由葡萄糖组成的生物大分子，除少数霉菌可以直接利用淀粉外，目前大多数微生物都不能直接利用淀粉，如氨基酸产生菌、酒精酵母、抗生素产生菌等。因此在氨基酸、抗生素有机酸等的生产中，都要求先对淀粉或淀粉原料进行糖化，制成淀粉水解糖后使用。将淀粉水解为葡萄糖的过程称为糖化，制得的糖溶液叫淀粉水解糖。,13,一、淀粉水解糖的制备方法,葡萄糖值-DE值,工业上用DE值（也称G值）表示淀粉糖的糖组成。糖 化液中的还原糖含量（以G计算）占干物质的百分率称为。,还原糖含量 DE值 = 100%干物质含量,用于制备淀粉的原料主要有薯类、玉米、小麦、 大米等富含淀粉的农产品。根据原料淀粉的性质及采 用的催化剂不同，淀粉水解为葡萄糖的方法有酸解法、 酶解法以及酸酶结合法等三种。,14,又称酸糖化法，它是以酸为催化剂在高温下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。优点：生产方便，设备简单，水解时间短，设备生产能力大； 缺点：a反应在高温高压及酸条件下进行，对设备有耐腐蚀、耐高温和耐高压的要求；b发生副反应，葡萄糖损失，淀粉的转化率低；c对原料要求严格。,1、酸解法,15,酶解法是利用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的方法。酶解法可分为两步： 第一步，利用-淀粉酶将淀粉液化； 第二步，利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解转化为葡萄糖。生产上这两步分别称为液化和糖化。由于在该过程中淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的。因此酶解法又称为双酶法或多酶法。,2、酶解法,16,1.酶解法是在酶的作用下进行的，反应条件较温和，不需要耐高温高压或耐酸腐蚀的设备； 2.酶作为催化剂的特点是专一性强，副反应少，故水解糖液纯度高，淀粉转化率高； 3.可在较高的淀粉乳浓度下水解。如酸解法一般使用含18%-20%淀粉的淀粉乳，而酶解法可用含34%-40%淀粉的淀粉乳，并且可以采用粗原料。 4.用酶解法制得的糖液较纯净、颜色浅、无苦味、质量高，有利于糖液的充分利用。,优 点,17,缺点,酶解法反应时间较长，设备要求较多，且酶是蛋白质，易引起糖液过滤困难。当然，随着酶制剂生产及应用技术的提高，酶解法制糖将逐渐取代酸解法制糖。,18,3酸酶结合法,酸酶结合法是集中了酸解法和酶解法制糖的优点而采用的生产方法，它又可分为： A、酸酶法：是先将淀粉用酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解成葡萄糖的工艺。一般采用将淀粉先用酸水解到DE值达10-15，在降温中和后，用糖化酶进行糖化。优点：酸液化速度快，糖化时可以采用较高的淀粉乳浓度，提高生产效率；酸用量少，产品的色泽浅，糖液质量高。,19,B、酶酸法：是先将淀粉乳用-淀粉酶液化到一定程度，再用酸水解成葡萄糖的工艺。有些淀粉原料颗粒大小不一，如用酸法水解，则常使水解不均匀，出糖率低。生产中应用酶酸法，可采用粗淀粉为原料，粉料浓度较酸解法高，生产易控制，耗时短，且酸解时PH值稍高，以减轻淀粉水解的副反应。从水解糖的质量和降低糖耗，提高原料的出糖率来看，酶解法最好，酸解法最差。从制糖过程所需的时间看，酸解法最短，酶解法最长。,20,4.2.2.2 淀粉酸水解原理及技术,1、淀粉酸水解原理,水解过程：,水解过程中存在三大化学反应：,复合二糖 复合低聚糖水解 淀粉 葡萄糖5-羟甲基糖醛 有机酸、有色物质,1,3,2,21,（1）水解反应速度,（C6H10O5)n+nH2O n C6H12O6,酸,影响水解反应速度常数k的几个因素,k=N,1）为催化剂活性系数,各种酸的值,2）N为酸的摩尔浓度,3）为多糖的水解性常数,22,4）为水解温度,不同温度下淀粉水解反应速度常数,结论：淀粉水解所用的催化剂种类、浓度、反应温度 均对水解反应速度有很大的影响，是我们在水解过程 中必须注意的主要因素。,（2）葡萄糖的复合反应,2C6H12O6 C12H22O11+H2O,酸和热,复合反应中两个葡萄糖分子通过复合反应聚合成二糖时，并不是经过1，4-糖苷键聚合成为麦芽糖，而主要是经由1，6-糖苷键聚合成异麦芽糖或经由1，6-糖苷键聚合成龙胆二糖。当然此复合反应是可逆的，复合糖可以再水解变成葡萄糖。,23,（3）葡萄糖的分解反应,葡萄糖（失水） 5-羟甲基糠醛 +甲酸腐植质（色素）,实验结果证明：1）5-羟甲基糠醛是产生色素的根源；2）色素的生成量随葡萄糖浓度的增加而增加；3）PH值等于3时，色素的生成量最小。,酸法水解淀粉过程中，由于反应温度、压力过高，时间过长，葡萄糖受酸和热的影响发生分解反应，生成5-羟甲基糠醛，因5-羟甲基糠醛的性质不稳定，又可进一步分解生成乙酰丙酸、蚁酸等物质，而这些物质又能自身相互聚合，或与淀粉中所含的其他有机物质相结合，产生色素。,24,1）酸法糖化工艺流程,淀粉,盐酸,蒸汽,水,调浆,糖化,冷却,中和脱色,压滤,滤渣,糖液,活性炭,Na2CO3,2、酸水解工艺,淀粉的酸水解工艺是根据淀粉在水解过程中的水解反应和复合反应规律性来决定的。在制定工艺条件时既要保证淀粉的彻底水解，达到较高葡萄糖量，又要尽可能减少葡萄糖复合、分解反应的发生程度，此外，还要符合目的产物的发酵条件，符合发酵工艺的实际情况。,25,2）水解条件选择及其控制,1、淀粉乳浓度的选择,2、HCl用量,浓度控制在18-19BX。,用量为淀粉量的0.6%-0.7%，淀粉乳 的PH为1.5左右。,26,3、水解时间,4、水解设备,一般15min，水解终点的检查，用无水酒精检查无白色为止。,不锈钢或搪瓷衬底设备。,5、糖化液,6、脱 色,冷却降温，并加纯碱中和调节PH为4.6-5.0，温度控制在60-70。,活性炭脱色，添加量为淀粉量的0.6-0.8，在PH4.6-5.0，温度65，搅拌脱色30min，经过滤掉蛋白质等杂质，即获得较纯的水解糖。,27,4.2.2.3 双酶法制糖原理,酶解法也称双酶法，它是由淀粉酶和糖化酶将淀粉糖转化为葡萄糖的方法。酶解法优点：以作用专一性的酶制剂作为催化剂，因此反应条件温和，复合和分解反应较少，因此采用酶法生产不仅可提高淀粉的转化率及糖液的浓度，而且还可大幅度地改善了糖液的质量，是目前最为理想、应用最广的制糖方法。缺点：时间长；过滤难。,28,1、淀粉酶解法的两个步骤,酶 水解位置 水解次序 水解产物液化 淀粉酶 1，4糖苷键 无先后次序 葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖异麦芽糖、低聚糖糖化 糖化酶 1，4和1，6 从非还原性 葡萄糖糖苷键 末端开始,一、液化过程，采用高温-淀粉酶，将高温糊化了的淀粉液化，生成糊精及低聚糖，使淀粉和其结合蛋白分离； 二、糖化过程，利用糖化酶将液化生成的糊精、低聚糖进一步水解生成葡萄糖。,29,淀粉糊化是指淀粉受热后，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失， 互相接触变成糊状液体，即使停止搅拌，淀粉也不会 再沉淀的现象。,由于淀粉颗粒的结晶性结构对酶作用的抵抗力非常强,不能使淀粉酶直接作用于淀粉,而需要先加热淀粉乳,使淀粉颗粒吸水膨胀、糊化，破坏其结晶性的结构。,1、液化原理,1）淀粉的糊化与老化,30,糊化温度：发生糊化现象时的温度称为糊化温度，一般来讲，糊化温度有一个范围。不同的淀粉有不同的糊化温度。 淀粉的老化：分子间氢键已断裂的糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程，也就是复结晶过程。 老化的弊端：淀粉酶很难进入老化淀粉的结晶区起作用，使淀粉很难液化，更不能糖化。糊化淀粉是在淀粉酶的作用下液化的，-淀粉酶可以水解淀粉分子链的-1，4糖苷键，不能水解-1，6糖苷键，但能越过-1，6糖苷键继续水解-1，4糖苷键，水解没有规律性的先后次序。,31,2、糖化的原理糖化酶又称糖化型淀粉酶或葡糖淀粉酶，它对底物作用是从非还原性末端开始切割，一个分子切割下葡萄糖单位。它不但可以水解-1，4糖苷键，而且也水解-1，6糖苷键和-1，3糖苷键。它可以直接将淀粉水解成葡萄糖，也能水解糊精、低聚糖，最终产物转化为葡萄糖。,酶的用量,原则：酶活力低，液化液浓度高，用量则多，反之则少。 生产用量：30%淀粉，80-100单位/克淀粉。,32,