系 统 实 验 之 二 T淋巴细胞功能测定,付海英 fuhaiying612yahoo.com.cn,实验内容,小鼠摘眼球取血、分离血清 淋巴细胞转化试验,教学要求,掌握小鼠血清的分离 掌握淋巴细胞转化试验的基本原理及基本操作,淋巴细胞转化试验 (Lymphocyte transformation test),原理 检测方法 操作步骤 应用,实验分组及材料,器材 酒精棉球 若干 无菌纱布块 1块/组 无菌平皿 1块/组 无菌吸头（大、中、小）4盒/room 无菌96孔培养板 1块/组 可调微量加样器 4套/room 细胞计数板 1套/组 显微镜 1台/组 EP管 若干 眼科剪、小镊子 4套/room 细胞培养箱（37 5%CO2),酶标仪 离心机 2个/room 超净台 2个/room 动物及试剂 小鼠 2只/组(NS,OVA) 培养液（IMDM) 无FCS 100ml/room 培养液（IMDM)20%FCS 30ml/room ConA（2.5,5,10g/ml) 各1.5ml/tube 白细胞计数液（2%冰醋酸）2瓶/room MTT（5mg/ml) 1.5ml/room 二甲亚砜（DMSO) 5ml/组,分组： 每组四人，两人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾脏,免疫血清分离过程,摘眼球取血,RT for 2hrs,Rotation 3000rpm for 20min,Transfer serum to a new EP,Double diffusion,Store at 4,ELISA,1.5ml EP,实验步骤,单细胞悬液的制备： 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。 于超净台内取出脾和胸腺组织(各1/2)，分别放入预先盛有2ml IMDM培养液的平皿内。 将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000l加样器隔着纱布将细胞悬液吸出，放入1.5ml EP管中。 细胞计数： 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20l，加到盛有980l计数液的EP管中，在显微镜下计数，计数方法见后。 调细胞浓度至1107/ml，所需量为1.5ml，设需要的细胞悬液体积为Aml,可按公式：?/mlA=1.51107 NOTE:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。,细胞计数板,查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm1mm0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y 104稀释倍数(50),4,细胞培养： 按图所示加板。 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37 5%C02培养箱中，培养48小时。 MTT掺入：（隔一天 下午2:00） 在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。 每孔内加入MTT（5mg/ml) 10l，加完后轻轻搕板，使MTT和细胞混匀。 在37 5%C02培养箱中继续培养2小时，然后离心2000rpm，5min，轻轻弃去上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）。 加入100l 二甲亚砜（DMSO)，将颗粒溶解。 （隔一天 下午4:00） 结果测定： 结果测量：用酶标仪测定光密度值：A570nm（用空白孔调零），记录结果。 结果判定： SI（刺激指数）=Con A刺激孔 A值 / 对照孔A值,预习内容,单克隆抗体的制备（理论P70，实验P106） 双向免疫扩散（理论P241，实验P116）,八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺 每孔加入100 l调好的细胞悬液 1-3孔加入10%FCS-IMDM 培养液， 100 l 4-6孔加入2.5 g/ml的Con A, 100 l 7-9孔加入5 g/ml的Con A, 100 l 10-12孔加入10 g/ml的Con A, 100 l NOTE:ConA用10%FCS-IMDM培养液配制,N.S.,OVA,N.S.,OVA,加 样 方 法,返回,八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺 每孔加入100 l调好的细胞悬液 1-3孔加入10%FCS-IMDM 培养液， 100 l 4-6孔加入2.5 g/ml的Con A, 100 l 7-9孔加入5 g/ml的Con A, 100 l 10-12孔加入10 g/ml的Con A, 100 l,N.S.,OVA,N.S.,OVA,加 样 方 法,