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系 统 实 验 之 二 T淋巴细胞功能测定,付海英 fuhaiying612yahoo.com.cn,实验内容,小鼠摘眼球取血、分离血清 淋巴细胞转化试验,教学要求,掌握小鼠血清的分离 掌握淋巴细胞转化试验的基本原理及基本操作,淋巴细胞转化试验 (Lymphocyte transformation test),原理 检测方法 操作步骤 应用,实验分组及材料,器材 酒精棉球 若干 无菌纱布块 1块/组 无菌平皿 1块/组 无菌吸头(大、中、小)4盒/room 无菌96孔培养板 1块/组 可调微量加样器 4套/room 细胞计数板 1套/组 显微镜 1台/组 EP管 若干 眼科剪、小镊子 4套/room 细胞培养箱(37 5%CO2),酶标仪 离心机 2个/room 超净台 2个/room 动物及试剂 小鼠 2只/组(NS,OVA) 培养液(IMDM) 无FCS 100ml/room 培养液(IMDM)20%FCS 30ml/room ConA(2.5,5,10g/ml) 各1.5ml/tube 白细胞计数液(2%冰醋酸)2瓶/room MTT(5mg/ml) 1.5ml/room 二甲亚砜(DMSO) 5ml/组,分组: 每组四人,两人一只小鼠,其中一人胸腺,一人脾脏,免疫血清分离过程,摘眼球取血,RT for 2hrs,Rotation 3000rpm for 20min,Transfer serum to a new EP,Double diffusion,Store at 4,ELISA,1.5ml EP,实验步骤,单细胞悬液的制备: 小鼠脱臼处死,用酒精棉球擦拭皮毛消毒。 于超净台内取出脾和胸腺组织(各1/2),分别放入预先盛有2ml IMDM培养液的平皿内。 将3-4层纱布覆盖到组织上,用直头镊子固定组织,用弯头镊子轻压组织,将其捣碎。然后用1000l加样器隔着纱布将细胞悬液吸出,放入1.5ml EP管中。 细胞计数: 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20l,加到盛有980l计数液的EP管中,在显微镜下计数,计数方法见后。 调细胞浓度至1107/ml,所需量为1.5ml,设需要的细胞悬液体积为Aml,可按公式:?/mlA=1.51107 NOTE:在稀释前一定将原细胞悬液混匀,否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。,细胞计数板,查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的细胞数:Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm1mm0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度(/ml)=Y 104稀释倍数(50),4,细胞培养: 按图所示加板。 将板做好标记,在倒置显微镜下观察细胞,然后放于37 5%C02培养箱中,培养48小时。 MTT掺入:(隔一天 下午2:00) 在终止培养前2小时,在显微镜下观察细胞转化情况。 每孔内加入MTT(5mg/ml) 10l,加完后轻轻搕板,使MTT和细胞混匀。 在37 5%C02培养箱中继续培养2小时,然后离心2000rpm,5min,轻轻弃去上清,(注意不要将孔底部的颗粒物弃出)。 加入100l 二甲亚砜(DMSO),将颗粒溶解。 (隔一天 下午4:00) 结果测定: 结果测量:用酶标仪测定光密度值:A570nm(用空白孔调零),记录结果。 结果判定: SI(刺激指数)=Con A刺激孔 A值 / 对照孔A值,预习内容,单克隆抗体的制备(理论P70,实验P106) 双向免疫扩散(理论P241,实验P116),八个人一块培养板,两人加脾,两人加胸腺 每孔加入100 l调好的细胞悬液 1-3孔加入10%FCS-IMDM 培养液, 100 l 4-6孔加入2.5 g/ml的Con A, 100 l 7-9孔加入5 g/ml的Con A, 100 l 10-12孔加入10 g/ml的Con A, 100 l NOTE:ConA用10%FCS-IMDM培养液配制,N.S.,OVA,N.S.,OVA,加 样 方 法,返回,八个人一块培养板,两人加脾,两人加胸腺 每孔加入100 l调好的细胞悬液 1-3孔加入10%FCS-IMDM 培养液, 100 l 4-6孔加入2.5 g/ml的Con A, 100 l 7-9孔加入5 g/ml的Con A, 100 l 10-12孔加入10 g/ml的Con A, 100 l,N.S.,OVA,N.S.,OVA,加 样 方 法,
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