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生物化学:酶 Enzyme,第一节 酶的分子结构与功能,第二节 酶促反应的特点与机制,第三节 酶促反应动力学,第四节 酶 的 调 节,第五节 固定化酶的制备,第六节 酶在医药学上的应用,酶 学 史 1878年 巴斯德 发酵是酵母细胞生命活动的结果, 出现酶的名称 1897年 Buchner兄弟 发酵过程不需要完整的酵母细胞 1926年 Sumner 分离得到脲酶结晶,并提出酶的化学本质是蛋白质 1930年 Northrop 分离得到胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶结晶并证实其均为蛋白质,酶的蛋白质本质确立。 1982年 Cech 发现核酶 (ribozyme),酶(enzyme)是由活细胞产生的生物催化剂,这种催化剂具有极高的催化效率和高度的底物特异性,其化学本质是蛋白质。,单体酶 寡聚酶 多酶复合体 多酶体系 多功能酶,酶的分类,第一节 酶的分子结构与功能,一、酶的分子组成 酶分子可根据其化学组成的不同,分为两类:,由酶蛋白与辅助因子组成的酶称为全酶。与酶蛋白疏松结合并与酶的催化活性有关的耐热低分子有机化合物称为辅酶。与酶蛋白牢固结合并与酶的催化活性有关的耐热低分子有机化合物称为辅基。,二、辅酶与辅基的来源及其生理功用,大部分的辅酶与辅基衍生于维生素。维生素的重要性就在于它们是体内一些重要的代谢酶的辅酶或辅基的组成成分。 维生素是指一类维持细胞正常功能所必需的,但在生物体内不能自身合成而必须由食物供给的小分子有机化合物。,维生素可按其溶解性的不同分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大类。 脂溶性维生素有VitA、VitD、VitE和VitK四种。 水溶性维生素有VitB1,VitB2,VitPP,VitB6,VitB12,VitC,泛酸,生物素,叶酸等。,由维生素衍生的辅酶或辅基:,1. TPP: 焦磷酸硫胺素,由硫胺素(Vit B1)焦磷酸化而生成,是脱羧酶的辅酶,在体内参与糖代谢过程中-酮酸的氧化脱羧反应。,2. FMN和FAD: 黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD),是核黄素(VitB2)的衍生物。 VitB2具有氧化还原性,酶蛋白与FMN或FAD结合后统称为黄素酶,催化脱氢氧化反应,其辅基FMN或FAD在酶促反应中作为递氢体(双递氢体)。,FMN 和FAD的分子结构,3. NAD+和NADP+:尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+,辅酶)和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+,辅酶)是Vit PP的衍生物。 在体内,由尼克酰胺参与构成的两种辅酶均有氧化型(NAD+,NADP+)和还原型(NADH+H+,NADPH+H+)两种形式。它们作为脱氢酶的辅酶,在酶促反应中起递氢体的作用,为单递氢体。,NAD+和NADP+的分子结构,4. 磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺: 磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺是Vit B6的衍生物,Vit B6包括吡哆醇,吡哆醛和吡哆胺等三种形式。磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺可作为氨基转移酶,氨基酸脱羧酶,半胱氨酸脱硫酶等的辅酶。,5. CoA: 泛酸(遍多酸)在体内参与构成辅酶A(CoA),后者的结构成分为3-磷酸腺苷-5-焦磷酸-泛酸-巯基乙胺。CoA中的巯基可与酰基以高能硫酯键结合,在糖、脂、蛋白质代谢中起传递酰基的作用,因此CoA是酰化酶的辅酶。,CH3CSCoA O,CoA,的分子结构,6. 生物素: 是噻吩与尿素相结合的骈环化合物,带有一戊酸侧链,有,两种异构体。生物素是羧化酶的辅基,在体内参与CO2的固定和羧化反应。,7. 四氢叶酸: 四氢叶酸( FH4 )由叶酸衍生而来。四氢叶酸是体内一碳单位基团转移酶系统中的辅酶,其N5和N10原子与一碳单位基团结合,与嘌呤和嘧啶的合成有关。,8. Vit B12的衍生物: Vit B12分子中含金属元素钴,故又称为钴胺素。Vit B12在体内有多种活性形式。其中,5-脱氧腺苷钴胺素是体内的主要形式,它可参与构成多种变位酶的辅酶,甲基钴胺素则是甲基转移酶的辅酶,与胆碱等的合成有关。,辅酶与辅基的生理功用主要是: 运载氢原子或电子,参与氧化还原反应。 运载反应基团,如酰基、氨基、烷基、羧基及一碳单位等,参与基团转移。,三、金属离子的作用,1. 稳定构象:稳定酶蛋白催化活性所必需的分子构象; 2. 构成酶的活性中心:作为酶的活性中心的组成成分,参与构成酶的活性中心; 3. 连接作用:作为桥梁,将底物分子与酶蛋白螯合起来。,酶的活性中心,四、酶的活性中心,酶分子上具有一定空间构象的部位,该部位化学基团集中,直接参与将底物转变为产物的反应过程,这一部位就称为酶的活性中心。,结合基团 活性中心内必需基团 催化基团 活性中心外必需基团,S-S,活性中心外 必需基团,结合基团催化基团,活性中心必需基团,底物,肽链,活性中心,酶活性中心示意图,活性中心: 能结合并催化一定底物使之发生化学变化,位于酶分子表面的一部分区域。活性中心由一条或几条多肽链上空间位置比较靠近的氨基酸残基或其上的基团组成, 这些基团包括: COOH、NH2、OH、SH和咪唑基等, 按照功能可将这些基团分为结合基 团和催化基团(影响底物化学键的稳定性), 统称必需基团。此外还有一些活性中心外必需基团对稳定酶分子的构象是必需的。,第二节 酶促反应的特点与机制,酶与一般催化剂的共同点包括: 能催化热力学上允许进行的化学反应,而不能实现那些热力学上不能进行的反应; 能缩短反应达到平衡所需的时间,而不能改变平衡点; 一般情况下,对可逆反应的正反两个方向的催化作用相同。,一、酶促反应的特点,(一)具有极高的催化效率: 酶的催化效率可比一般催化剂高1061020倍。 如:H2O2 H2O + O2 H2O2酶为 5106 mol ; Fe2+ 为610-4 mol,催化反应历程,一般化学反应历程: S P 酶促反应历程: S + E ES E + P,酶促反应的活化能,(二)具有高度的底物特异性:,一种酶只作用于一种或一类化合物,以促进一定的化学变化,生成一定的产物,这种现象称为酶作用的特异性。,1绝对特异性:一种酶只能作用于一种化合物,以催化一种化学反应,称为绝对特异性。 2相对特异性:一种酶只能作用于一类化合物或一种化学键,催化一类化学反应,称为相对特异性。 3立体异构特异性:一种酶只能作用于一种立体异构体,或只能生成一种立体异构体,称为立体异构特异性。,(三) 酶的催化活性是可以调节的: 许多因素可以影响或调节酶的催化活性,如代谢物、对酶分子的共价修饰,酶蛋白的合成改变等。,二、酶促反应的机制,(一)中间复合物学说: 酶催化时,酶活性中心首先与底物结合生成一种酶-底物复合物(ES),此复合物再分解释放出酶,并生成产物。 S + E SE S + P,(二) 诱导契合学说: 当底物与酶接近时,底物分子可以诱导酶活性中心的构象发生改变,使之成为能与底物分子密切结合的构象 。,(三)与酶的高效率催化有关的因素:1趋近效应与定向作用; 2张力作用; 3酸碱催化作用; 4共价催化作用; 5酶活性中心的低介电区(表面效应)。,第三节 酶促反应动力学,酶反应动力学主要研究酶催化的反应速度以及影响反应速度的各种因素。 在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时,通常测定其初始速度来代表酶促反应速度,即底物转化量5%时的反应速度。,一、底物浓度对反应速度的影响,(一)底物对酶促反应的饱和现象:,反应级数:,(二)米氏方程式的推导:,Michaelis & Menten 于1913年推导出了上述矩形双曲线的数学表达式,即著名的米氏方程。 Vmax ,(三)Km和Vmax的意义:,1. 当=Vmax/2时,Km=S。因此,Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。,2. Km可以反映酶与底物亲和力的大小。Km越小,酶与底物的亲和力越大。 3.可用于判断反应级数:当S100Km时,=Vmax,反应为零级反应;当0.01KmS100Km时,为混合级反应。,Km是酶的特征性常数:在一定条件下,某种酶的Km值是恒定的,因而可以通过测定不同酶(特别是一组同工酶)的Km值,来判断是否为不同的酶。5. Km可用来判断酶的最适底物:当酶有几种不同的底物存在时,通过测定酶在不同底物存在时的Km值,Km值最小者,即为该酶的最适底物。,6. 可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度:当S=10Km时,= 91%Vmax,此时即为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。 7. Vmax可用于计算酶的转换数:当酶的总浓度和最大速度已知时,可计算出酶的转换数,即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。,(四)Km和Vmax的测定:,1. Lineweaver-Burk双倒数作图法:,2. Hanes作图法:,二、酶浓度对反应速度的影响,当反应系统中底物的浓度足够大时,酶促反应速度与酶浓度成正比,即=kE。,三、温度对反应速度的影响,一般来说,酶促反应速度随温度的增高而加快。但当温度增加达到某一点后,由于酶蛋白的热变性作用,反应速度迅速下降,直到完全失活。酶促反应速度随温度升高而达到一最大值时的温度就称为酶的最适温度。,温度对酶促反应速度的影响,酶的最适温度与实验条件有关,因而它不是酶的特征性常数。 低温时由于活化分子数目减少,反应速度降低,但温度升高后,酶活性又可恢复。,四、pH对反应速度的影响,观察pH对酶促反应速度的影响,通常为一“钟形”曲线,即pH过高或过低均可导致酶催化活性的下降。 酶催化活性最高时溶液的pH值就称为酶的最适pH。,pH对酶促反应速度的影响,人体内大多数酶的最适pH在6.58.0之间。 酶的最适pH不是酶的特征性常数。 pH对酶促反应速度的影响,其原因主要是由于pH的改变导致了酶的催化基团以及底物分子的解离状态改变或者导致了酶蛋白的变性。,五、抑制剂对反应速度的影响,凡是能降低酶促反应速度,但不引起酶分子变性失活的物质统称为酶的抑制剂(inhibitor)。 按照抑制剂的抑制作用,可将其分为不可逆抑制作用(irreversible inhibition) 和可逆抑制作用(reversible inhibition)两大类。,(一)不可逆抑制作用: 抑制剂与酶分子的必需基团共价结合引起酶活性的抑制,且不能采用透析等简单方法使酶活性恢复的抑制作用就是不可逆抑制作用。,(二)可逆抑制作用:,抑制剂以非共价键与酶分子可逆性结合造成酶活性的抑制,且可采用透析等简单方法去除抑制剂而使酶活性完全恢复的抑制作用就是可逆抑制作用。 可逆抑制作用包括竞争性、反竞争性、和非竞争性抑制几种类型。,1.竞争性抑制(competitive inhibi-tion): 抑制剂与底物竞争与酶的同一活性中心结合,从而干扰了酶与底物的结合,使酶的催化活性降低,称为竞争性抑制作用。,竞争性抑制的速度方程与图形特征,竞争性抑制的双倒数图形特征,竞争性抑制的特点: 竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物; 抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同; 抑制剂浓度越大,则抑制作用越大;但增加底物浓度可使抑制程度减小; 动力学参数:Km值增大,Vm值不变。,丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制,磺胺类药物对二氢叶酸合成酶的竞争性抑制,对氨基苯甲酸,对氨基苯磺酰胺,2反竞争性抑制:,抑制剂不能与游离酶结合,但可与ES复合物结合并阻止产物生成,使酶的催化活性降低,称酶的反竞争性抑制。,反竞争性抑制的速度方程 与图形特征,反竞争性抑制的双倒数图形特征,反竞争性抑制的特点: 反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似; 抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合; 必须有底物存在,抑制剂才能对酶产生抑制作用;抑制程度随底物浓度的增加而增加; 动力学参数:Km减小,Vm降低。,
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