人胚胎三叉神经的形态及三维重建人胚胎三叉神经的形态及三维重建前前 言言作为脑组织神经的一个主要组成部分，三叉神经内部具备两大神经纤维：一是内脏运动纤维；二是躯体感觉纤维。前者处于三叉神经的运动部核心部位，脑桥中间部位三叉神经的运动根源是由轴突所构成，小脑与脑桥的最低层处于感觉根的前面一部分的内部，进而融入下颌神经系统，通过圆形小孔进入到颅腔之中，经过下颌神经系统，最终处于人体咀嚼肌部位。在人体三叉神经之中，还包含了躯体感觉神经细胞，感觉根的组成者为中枢突集，此感觉根处于三叉神经的内部，进入大脑的途径为：从小脑与脑桥最底层的交汇处直接进入，最终处于感觉核；在三叉神经的内部，包含了 3 个分支，这 3 个分支分别为上颌、下颌以及眼部神经等，在这 3 大分支的共同作用下，人体面部表层将表现出基本的分支架构，主要的部位有眼睛、牙齿、鼻子、口腔内部、皮肤等。研究发现，人类脑神经痛作为基本的病症之一，而脑神经痛中有一类叫做三叉神经痛的疾病，此种疾病作为脑神经系统中最为常见的一种疾病。据统计，每十万人之中就有 182 个人患有三叉神经痛，主要的病原区分布于 3 个分支中的一支或者几支之中。在三叉神经痛的患者之中，有些患者的面部通常会出现短暂而又快速的疼痛，这种疼痛如同针刺、触电一样，表现的十分迅速，而疼痛的主要部位分布在患者的面部、舌头以及上、下颌等器官之上。现阶段，我国对于三叉神经痛的病因研究尚处于初级阶段，并没有找到其发病根源，也没有切实可行的医治办法。在我国，对三叉神经痛进行医治的主要方法为手术治疗，手术治疗的过程中，基本上是对其感觉根的医治，通常将感觉根切断，这种技术就是当前我国常用的手术方式之一。然而，进行手术医治的同时，极有可能造成对运动肌肉的损伤，运动肌肉损伤之后，患者会感到一侧的咀嚼肌表现麻木，牙齿上下活动不灵敏，与此同时，上、下颌闭合不顺畅。此外，还有部分三叉神经痛患者在吃饭张口的时候感到极为困难，有的时候还会出现张口偏移等现象。由此可以看出，在进行手术医治的时候，一定要找准位置，特别是要做好对运动支和感觉支的有效判断，做好对二者之间既定关系的分析。所以，一定要做好对三叉神经根医学方面的深入考究，特别是要做好对运动根的研究和分析，全面掌握运动根在三叉神经中的运动规则，与此同时，还需要了解运动根对三叉神经痛医治方面的影响。包含我国在内的众多国家的专家学者，对于成年人的三叉神经做了专门的细致，特别是对于运动根的移动规律和本质形态做了深入的研究，为此还提出了多方面的建议和意见。Young 和一部分专家学者在对成年人三叉神经研究的过程中，总结和发掘出了成年人三叉神经中包含了一些纤维，这些纤维是无髓的，并且没有发现对三叉神经根有那些特别的影响和意义。然而，有部分专业人士对其做了间接地证明，证明了这部分纤维是存在一定的意识和感觉的，究其原因，极有可能与感觉根切断之后患者仍然存在的感觉有着密切的关联。Ezure 与相关专业学者对感觉根和轴突进行了研究、探索，研究得出了感觉根的周长和面积均小于轴突的周长和面积，并且感觉根的数量和范围并没有轴突的多和大，a 类纤维也不存在于感觉根之中。孙尔玉与一些专业人士通过对死人大脑的剖析，使用显微镜对人体大脑部位的三叉神经做了深入的分析，最终指出了在三叉神经系统中的感觉根和运动根之各自的位置，并且指明了二者之间的联系。专家表示，感觉根与运动根之间有交叉节支的存在，然而从发育学方面出发，截止现在，仍然没有出现二者移动相关联的有关研究成果。在前面的研究过程中，实验操作人员对人体胚胎内部的三叉神经进行了持续性切片分析，采用 HE 正常着色、PS 重新组建的方法，与此同时，还采用了对 DiI 进行冰冻切片的方法，并且置于显微镜下进行密切观察，通过 HE 正常着色和 PS 重新组建之后的胚胎分支图表现的非常清晰，然而为二维图片，只能看出大概的轮廓，仍然不能确认起始细胞之间有没有交叉的部位，也无法做出具体、详细的说明。跟随着医学方面科技水平的逐步提高，DiI 荧光标记技术得到突飞猛进的发展，采用 Dii 荧光标记技术，能够深入、客观、详细的做好对人体脑部成长、轴突变化、大脑内部纤维之间的关系以及人体神经系统的研究和分析。我们在神经系统传输方面经常用到一种专业工具，即就是荧光标记物，荧光标记物作为一种染料。在传统的研究领域中，DiI 染色晶体重点进行动物神经系统的分析和研究，在这一领域的投入使用效果非常好。目前，DiI 不但被应用到动物神经系统研究之上，而且也逐步投放到人类神经系统研究领域之中。DiI 染色晶体具备了不易溶于水和良好亲脂性的特性，它在人体大脑中具备不易扩散的能力，通常极易融入到生物角膜之中，在整个运动的过程中，不断的对细胞进行有效标记。可以说 DiI 常常被运用在无髓和正处于发育阶段的纤维之中，当然也能够被运用在甲醛稳定之后的标本之中。DiI 染色晶体在神经纤维中具有良好的散发性，基于此种特殊性质，它通常被用于研究神经纤维移动跟踪方案的分析和探究之上。基于上述一系列的研究方法，本文将选用胎龄在二十周之上的引产胎儿作为实验用材，这里引产的胎儿并不是因为疾病所致，也就是比较健康的。二十周以下的胎儿三叉神经并没有发育健全，并且个体太小，故不纳入研究的范围之内。经过对选取的实验标本的各个分支进行 HE 正常着色、DiI 染色跟踪，采用显微镜观察的方式，进行三维效果的重新组建，接下来对三叉神经系统的运动根进行了深入的分析和研究，主要研究其移动规律，通过此实验方法的设计，有助于对人体三叉神经的有效研究，与此同时，为我们后面的 DiI 荧光染色三维重新组建奠定了基础，此外，也满足实验者对人体三叉神经系统各个分支的研究愿望，达到了实验预期的效果，促进了人体三叉系统研究事业的更进一步。选材与实验选材与实验1.1.选材选材1.11.1 用于实验的材料选择用于实验的材料选择用于本实验的材料来自于引产二十周以上的胎儿数例，前提是这些胎儿的引产并不是因为疾病，也就是健康的胎儿。将这些胎儿分成两组，第一组拥有四例，将这四例用于研究三叉神经神经根、分支 HE 着色以及三维式重新构建的研究；第二组拥有三例，将这三例用于 DiI 跟踪实验的研究。在实验过程中，对胎儿的性别没有要求，胎龄要求在二十周之上，胎龄的计算方式为孕妇最后一次月经，并通过 B 超检测结果获取，这些胎儿都是来自新疆乌鲁木齐市区医疗机构，实验的时间为胎儿引产之后第一时间。在实验开始之前，使用生理盐水将胎体冲洗干净，然后经主动脉注入 1 至 1.5L 的 10%的福尔马林液体，注入的目的是为了防止胎体内部组织由于时间的原因而发生变异，在本实验过程中，注入 10%的福尔马林溶液的时间标准为距离成功引产后的四个小时以内。1.21.2 实验选用的主要试剂实验选用的主要试剂（1）由日本医科大学所提供的 DiI 染色晶体；（2）由福州迈新生物技术开发有限公司提供的 PBS 粉剂；（3）由西安化学试剂厂所提供的甲醛溶液分析纯和无水乙醇；（4）国产伊红、磷酸二氢钾、二甲苯、氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾以及苏木素等；（5）新疆医科大学所提供的 10%的福尔马林液体、蒸馏水以及 2.5%戊二醛。1.31.3 实验过程所用仪器实验过程所用仪器（1）厦门 MoticBA400 型荧光显微镜一台；（2）海尔电冰箱一台；（3）日本 Nikon4500 数码照相机一部；（4）由新疆医科大学第一附属医院提供的外科显微镜一台；（5）日本犯 M 一 1230 型透射电镜一台；（6）由梅特勒一托利多仪器有限公司提供的电子分析天平一台；（7）由新疆医科大学人体解剖教研室所提供的常规手术器械若干；（8）山东淄博善航医学工程研究所制造的曹工牌显微手术器械；（9）厦门 MoticBA600 型全自动显微镜一台；（10）日本医科大学第二解剖学教室三维重建计算机一台；（11）由新疆医科大学人体解剖教研室所提供的尸体解剖台；（12）瑞典制造的 LKB 一 2188 型超薄切片机一部；（13）由三洋电机国际贸易有限公司制造的 MLS 一 3750 型实验室用高压灭菌器一部；（14）由德国制造的莱卡 2135 型石蜡切片机一部等。2.2.实验方案设计实验方案设计2.12.1 稳固实验选材稳固实验选材当得到胎体之后，要在四个小时之内将胎儿的前胸打开，打开的时候要用钳子捏住胎儿的脐带，打开之后的心包将暴露在外面，然后打开心包，让心脏暴露出来。然后在主动脉的根部用七号输液针、50ml 的注射器注入 0.9%的生理盐水，注射的生理盐水质量为 0.5L，注入的时候，要在心房处切开一个小口。清洗完心脏之后，将 1.5L 的 10%的福尔马林注入进去，注入的时候要找到循环部位，注射完毕之后要仔细查看胎体的稳定状态。如果有液体从胎体的嘴巴、鼻子等部位流出，胎体的腹部鼓起、胎体变得僵硬起来，则说明标本已被稳定。然后将稳固好的胎体置于 10%的福尔马林液体中进行稳固，置于阴凉干燥处存放待用。2.22.2 显微镜查看显微镜查看当四个实验样本稳固完成之后，取下胎体的大脑，然后开启胎体的颅骨，将大脑暴露出来。接下来要取下一半闹球，通过显微镜取下一部分中脑，在显微镜下仔细观察三叉神经根、分节以及 3 个分支，并且拍下实物的照片，以供实验使用。2.32.3 电镜查看电镜查看(l)选取实验用材：第一组的四个标本在显微镜之下，被取出右脑的三叉神经根、分节以及分支，将损坏组织修补之后，用眼睛就可以直接看到三叉神经根，在这里我们要将其剥离掉，以供实验选取。（2）前期稳固：将筛选出来的脑组织存放在 2.5%的戊二醛液体之中，存放的时间为三天三夜。（3）清洗：经过稳固之后的胎体移出之后，放在 PH 值为 7.4 的 1/15M 磷酸液体之中，经过三次的清洗，每一次的清洗时间要保持在十五分钟以上。（4）后期稳固：将经过清洗之后的组织存放在 1%的饿酸固定液中，进行一个小时的后期稳固。（5）清洗：这个过程与第（3）过程相同。（6）去水：首先，将标本分别置于 50%、70%、80%、90%、100%的酒精之中进行十五分钟的去水操作，然后，再次将标本放在 100%的酒精溶液之中。（7）浸泡：首先，将所选的四例标本分别置于 1:1 的环氧树脂和丙酮液体中进行浸泡，浸泡的时间为一个小时；然后，在 3:1 的环氧树脂和丙酮液体中进行浸泡，浸泡的时间为三个小时；最后，在环氧树脂液体中进行浸泡，浸泡时间为十二个小时。（8）埋藏：将标本置于纯环氧树脂之中，在 37 摄氏度的条件下埋藏十二个小时，在 45 摄氏度的条件下埋藏十二个小时，在 60 摄氏度的条件下埋藏二十四个小时。（9）切片：在这里我们选用的切片规格为瑞典 LKB 一 2188 型，此类切片比较薄，选取一两个切片，经过甲苯胺蓝染色之后，置于外科显微镜下进行查看，参考相关结果，对神经元系统选择的时候，尽可能的选取数量较多的部位，然后再实施切片工作。（10）着色：在本实验之中，我们对切片进行着色的时候，通常选取柠檬酸铅和醋酸双氧铀进行着色。（11）查看：将经过着色处理的切片置于电镜下进行查看，并且进行照片的拍摄，这里所使用的电镜型号为日本生产的正 M-1230 型电镜。2.42.4 HEHE 着色与三维重新组建着色与三维重新组建2.4.12.4.1 HEHE 着色过程着色过程(l)实验材料的选取：当第一组中的四个胎体完全稳固之后，取下头部，用 PBS 进行清洗，清洗完毕之后，沿着颧骨边缘一厘米处进行头皮的剥离，剥离头皮之后，将颅盖打开，沿着水平面割掉硬脑膜，剪断脑干，去除间脑和端脑，然后去除小脑幕以及硬脑膜，这里的硬脑膜处于三叉神经之上，最后，将三叉神经根、3 大分支以及脑干颅底一同放在显微镜之下进行观察。其中有两例标本确定为右侧三叉神经根、神经节、3 大分支、上颌、下颌神经的位置，相反，剩余两例将确定左侧位置。在这两组之中，都需要对眼睛神经的割除，然后切断上颌神经和下颌神经，在脑桥最底层剥离三叉神经根，然后将其拿下，与此同时，还需要将神经分节、分支切割下来，待组织修正完成之后，存储于10%的福