枯草芽孢杆菌发酵的实罐操作,第三部分,枯草芽孢杆菌的实罐操作 实验材料及仪器设备,10L-100L 二级发酵罐及其附属设备 分光光度计 旋转式摇床 离心机 水浴锅 恒温培养箱 超净工作台 全自动灭菌锅 摇瓶 移液管 玻璃棒 烧杯 等玻璃仪器 试剂 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 蒸馏水 氢氧化钠 DNS试剂 1%淀粉,实训意义,生化工艺实训是为了让学生掌握一定的生物化工工艺单元操作基本技能的基础上进行的一次综合性实践训练。主要对有机品发酵过程中常见的单元操作过程及设备进行的基本操作技能训练。,防止染菌的要点,染菌是抗生素发酵的大敌，不制服染菌就不能实现优质高产。影响染菌的因素很多，而且带随机性质，但只要认真对待，过细地工作，染菌是可以防止的。请到左边的导航栏里选择查看防止染菌的要点的内容。,空气系统的要求,防止空气带菌主要是提高空压机进口空气的洁净度，防止空气夹带油和水及空气过滤器失效。 提高空压机进口空气的洁净度，可以从提高吸气口的位置及加强空气的压缩前过滤着手。防止空气夹带油、水，除加强去除油、水的措施外，还必须防止空气冷却器漏水，注意勿使冷却水压力大于空气压力，防止冷却水进入空气系统。,蒸汽系统的要求,重视饱和蒸汽的质量，要严防蒸汽中夹带大量冷凝水，防止蒸汽压力大幅度波动，保证生产时所用的蒸汽压力在3035千帕以上。,1、连续灭菌设备：连消塔结构要求简单，易于拆装和清理，操作时蒸汽能与物料混合均匀，并易于控制温度。 2、发酵罐：发酵罐及其附属设备应注意严密和防止泄漏，避免形成“死角”。凡与物料、空气、下水道连接的阀门都必须保证严密度。 3、无菌室：用超净工作台及净化室代替无菌室，以提高无菌程度。,一、种子的制备,1.1种子的制备 1.2培养基 基础培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 0.5g 蛋白胨 1g 氯化钠 0.5g 蒸馏水 100ml PH 7.07.2 1.3将配置好的培养基放入250ml的三角瓶中装液量为100ml。装液后进行高温灭菌,1.4一级种子的制备 选取长势良好的菌种，挑取菌落23环接种导液体摇瓶中。培养条件：180r/min，37摄氏度摇床过夜培养。 1.5二级种子液的制备 将一级种子液接种到药瓶培养基中接种量为5ml。培养条件：180r/min，37摄氏度摇床过夜培养。,二、发酵培养基配置,2.1发酵培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 0.5g 蛋白胨 1g 氯化钠 0.5g 蒸馏水 100ml PH 7.07.2 2.2将发酵培养基按照上述配方比例配好共配培养基45L（由于灭菌过程中有产生大量冷凝水，所以去掉5L）。,三、空罐灭菌,3.1空气过滤器灭菌，灭菌后对空气过滤器通空气进行保压，使压强保持在0.10.15mpa之间防止染菌。 3.2对罐体进行夹套预热85摄氏度以上。 3.3温度到达后，关闭夹套进气开关。通热蒸汽对罐体经行升温，当温度达到120摄氏度、压强0.11mpa时，保持温度和压力20min。 3.4灭菌后，关闭蒸汽进气阀，开大放气阀，进行泄压。,四、实灌灭菌,4.1泄压后，从进料口开始添加培养基，并开始搅拌（转速130r/min） 4.2进料完毕后开始调节PH值 4.3调好PH后，对罐体进行夹套预热85摄氏度以上。 4.4温度到达后，关闭夹套进气开关。通热蒸汽对罐体经行升温，当温度达到120摄氏度、压强0.11mpa时，保持温度和压力20min。 4.5灭菌后，关闭蒸汽进气阀，开大放气阀，当压强下降到0.08mpa时开启通气阀。使罐内压力保持在0.05mpa左右。 4.6开启冷水阀门，对发酵罐进行降温。,五、接种,5.1当罐温降到37摄氏度后，关闭冷水。用酒精将接种口处仔细擦洗，并放上接种火圈。 5.2减少进气，使罐压保持在0.02mpa，点燃接种火圈。 5.3拧下进料口螺盖，放入酒精中。 5.4按接种瓶的瓶口在火焰上灼烧一下，并在火焰的保护下迅速，将菌种到入发酵罐。 5.5寻上进料口螺盖，熄灭火焰。并用酒精仔细清洗。,接种 在无菌环境下进行,六、发酵,6.1发酵条件：37摄氏度、压强0.07kpa、搅拌转速200r/min 6. 2取样：取样前用热蒸汽将出料口处进行灭菌10min。 发酵参数的测定 1PH值的测定：用精确的PH试纸测。,2生长曲线：分光光度计波长600nm测od值（以相同稀释倍数的培养基做空白）。以生长量为纵坐标，培养时间为横坐标绘制生长曲线图。 3淀粉酶活力的测定： 1.发酵液离心处理：8000rpm，5min 2.1ml离心后的发酵液+5ml 1%淀粉溶液与37摄氏度水浴5min终止反应。 3.取上述溶液1ml，加入DNS试剂2.0ml于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用水迅速冷却 ，加去9ml蒸馏水，摇匀，在540nm波长处测定吸光值。以1%淀粉溶液直接加热煮沸再加DNS试剂反应作为空白。,七、发酵过程中参数检测结果,酶活曲线,菌浓曲线,八、实训结果总结及分析,经指导老师后期提示才知实验过程中空白试剂成分错误，造成试验结果一定性的误差。下次试验一定注意。 通过本次实训对本专业的相关知识和操作有了更深层的理解和认识。,九、实训的后期处理,打扫实训室、清理试验器具 整理实验数据、实训报告 绘制生长曲线及酶活曲线 进行实训总结,谢谢观看,