为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划folin_wu法测定血糖含量实验报告实验三：福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度一、实验目的1学会制备无蛋白血滤液。2掌握FolinWu法测定血糖含量的原理和方法。3掌握7200型可见分光光度计的使用方法。二,实验原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。三.实验仪器1试管2移液管3卵清蛋白片47220分光光度计四.实验试剂1、碱性硫酸铜溶液A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml.B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。临用时，A液：B液=9：1混合，混合液于冰箱中保存。2、标准葡萄糖溶液(1)1%葡萄糖母液：称取葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。(2)葡萄糖标准液：取葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。3、10%钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。4、/LH2SO4溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。五.实验步骤1、无蛋白血滤液的制备：用奥氏吸管吸取全血1ml,缓缓放入100ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后加10%钨酸钠1ml，摇匀.。再加/LH2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置515分钟，至沉淀变为暗棕色。用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。2、血糖的定量测定：取25ml的血糖管3支，编号。第一支血糖管中加入2ml蒸馏水；第二支血糖管中加2ml标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第三支血糖管中。然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后,勿摇动，各加4ml酸性钼酸盐溶液。一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7200分光光度计在420nm波长处比色，以空白管调节零点。六.数据处理按下式计算100ml全血中所含血糖的含量m=A1/A0C0100式中:m=100ml全血中含血糖毫克数;C0=标准液葡萄糖含量A1=样品液光吸收值;A0=标准液光吸收值无蛋白血溶液相对于全血得出m=七.实验分析一提高实验准确度的措施？1应尽可能把移取的血液完全放出，即等待挂在壁上的血液滴下后再进行接下来的操作。2若过滤后滤液浑浊不为无色透明，则应二次过滤。3尽量保证三只试管水浴时间相同。二、实验中，血糖管有什么作用？由于空气中的氧对Cu2O会产生再氧化作用从而影响测定结果，为减少Cu+与空气的接触，通过血糖管的细颈阻挡空气，防止形成Cu2+。三.实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管？使其尽快降温，防止高温使钼蓝氧化。福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度一、原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。二、实验仪器1.卵清蛋白片分光光度计3.试管4.移液管三、实验试剂酚试剂A：碱性铜溶液甲液：取Na2CO32g溶于/l氢氧化钠溶液中乙液：取晶体，溶于1%酒石酸钾100ml中。临用时按甲：乙=50：1混合使用。酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。/mL牛血清蛋白液：称取1g牛血清蛋白片溶于%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml四、实验步骤1.标准曲线的绘制取7支干燥洁净的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。2.样品测定准确吸取样液于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。五、实验结果标准曲线的绘制：蛋白质浓度吸光度则根据y=得x为，则样液的浓度为/ml.六、实验结果分析及思考1、试说明Folin-酚法的优缺点该方法较双缩脲法反应灵敏，与/ml浓度的蛋白质样品亦可得到很好的显色反应，使用很广泛，但花费时间长，其干扰因素较多。2、Folin-酚试剂法测定蛋白质含量为什么比双缩脲法灵敏？此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin酚B试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。Folin酚试剂由A试剂和B试剂组成。A试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。B试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。由此可见是它们的显色灵敏度不同造成的。3、Folin酚法测蛋白质含量为什么要求加入乙试剂后立即混匀？第一步相当于双缩脲反应，在碱性条件下蛋白质中的肽键与Cu2+作用生成络合物；第二步是基于Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物(呈蓝色反应)，因此需要快速混匀,继续实验生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：XX级生物信息学组别：第8实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称实验日期合作者评分Folin-酚试剂法测定蛋白质含量XX-11-2教师签名实验地点指导老师批改日期第8实验室一、实验目的1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。2、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。3.熟悉分光光度计的用法。二、实验原理1.在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质-Cu2+复合物。2.蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。3.在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。三、材料与方法1.实验材料样品健康人血清；正常人血清蛋白质含量：6080g/L试剂牛血清白蛋白标准液；碱性硫酸铜溶液；Folin-酚试剂仪器与器材V-1100分光光度计；恒温水浴箱；试管6支、试管架；加样枪、加样枪架；坐标纸2.实验步骤图示取6支试管做好标记，再按下表加样：加样时按横向顺序加样，并在加入碱性硫酸铜时：于1号试管加入碱性硫酸铜溶液2ml后等待1分钟再往下一支试管加入等量的碱性硫酸铜溶液，摇匀。以此类推。在全部试管加完碱性硫酸铜试剂之至距第一支试管加样10分钟后，于第1支试管立即加入Folin-酚试剂，并于2s内摇匀。1分钟后第2支试管加入Folin-酚试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。加样完毕后将各试管每隔1min按1-6顺序放一只试管入水浴箱，分别40水浴10min后取出冷却至室温。以500nm波长比色，以1号管作空白对照，按2-6顺序每隔一分钟测定一支试管内溶液吸光度并重复测三次，记下读数，求出平均值，记录数据并计算结果。四、结果与讨论1.实验现象记录在向试管中加入2ml碱性硫酸铜溶液并摇匀后，溶液澄清，无明显现象；在向试管中加入Folin-酚试剂并立即摇匀时观察到：溶液由浅绿立即先变黄后变浅蓝，且蓝色随时间延长而有所加深。2.实验数据记录各管A值测定次数212334562.绘制标准曲线将测得样品管吸光度代入标准曲线公式y=中，得出样品浓度为g/ml。即：C=C2300=g/ml600=60780g/ml=/L正常人血清蛋白浓度参考范围为：6080g/L以上依赖所得实验数据分析得出的待测蛋白浓度落在正常范围内，可认为本次实验成功。3.讨论本次实验中操作严格按照实验要求进行，故所测样品结果/L落在正常范围内，故可认为本次实验成功。4.误差分析在使用加样枪移液过程中可因试液未完全放入试管而有少许残留于移液枪头导致操作误差。在使用分光光度计测吸光度时，因未能及时将溶液转移至比色皿而导致分别目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。