为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划gus报告基因检测一、实验原理：1、适宜的反应条件下，-葡萄糖苷酸酶可将XGluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。二、实验步骤：1、将准备好的拟南芥植株放入小EP管中，加入染色液浸没试材，封好盖子；2、37培养箱中温育1小时至过夜；3、将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色为止。4、观察结果。三、实验结果：转基因拟南芥野生型拟南芥转基因拟南芥；野生型拟南芥转基因拟南芥四、分析讨论：1、预期结果：转基因植株被染成蓝色，野生型植株不被染色。实际结果：与预期结果一致，但野生型脱色不完全，有几片叶子的叶绿素未被脱掉。分析：实验较为成功。由上图可知，转入的基因在整棵植株都有表达，其中蓝色在叶脉中最深，推测转入的基因在叶脉中表达最多。在野生型植株中，大部分叶子被乙醇脱去叶绿素而呈现浅黄色。2、gus基因是目前常用的一种报告基因，是D葡萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物-葡萄糖苷酸酶(GUS)能催化裂解一系列的葡萄糖苷酸，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-葡萄糖苷酸酯分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。3、gus基因的最大优点是它能测定外源基因表达的具体细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。4、gus基因是一种报告基因，报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。报告基因是研究基因调控的有力工具，常用于判断试验基因的转化效率以及基因的调控与功能的研究实验中。5、报告基因必须具备的条件有：(1)已被克隆和全序列已测定;(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物;(3)报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好，表达产物能进行定量测定；(4)细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测。6、利用报告基因表达载体的研究技术的优点有：(1)避开内源和外源基因表达水平的影响：对于报告基因编码产物的检测水平可以精确地反映基因启动子的转录活性，不会受到内源性基因表达产物水平的影响；(2)易于检测：如果研究不同基因启动子的转录活性，采取本身基因表达产物的检测方法，必须建立各种基因表达产物的检测方法，有些基因的表达产物的检测技术还不具备，或者很难建立，而采用报告基因的研究策略就很容易解决这一问题，只要建立稳定的报告基因表达的检测技术就可以用于不同基因启动子转录活性的检测和研究。1GUS报告基因的定性检测GUS能与显色底物X-gluc反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性研究GUS的表达水平和表达模式。GUS染色的稳定性好，组织定位精确，成为在植物中运用很广的报道基因。GUS染色底物的配制按下表1配制GUS染色的底物。表1.GUS染色底物的配制GUS能与底物MUG反应产生荧光物质MU。MU的激发波长为365nm，发射波长为456nm，其含量可由荧光分光光度计测出。因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。试剂配制1)1mol/LNa2HPO4溶液：Na2HPO4溶于100ml水。2)1mol/LNaH2PO4溶液：NaH2PO4溶于100ml水。3)磷酸缓冲液()：1mol/LNa2HPO4取，1mol/LNaH2PO4取，定容至100ml。4)10SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10gSDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节PH至，然后加水定容至100ml。5)MEDTA()：在80ml水中加入Na2EDTA?2H2O，用NaOH调PH至，溶解后定容至100ml。6)GUS酶提取液：磷酸缓冲液取50ml；10%SDS取1ml；EDTA()取2ml；TritonX-100取100ul；-巯基乙醇100ul；用水定容至100ml。7)MUG底物：称MUG，溶于10mlGUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。8)反应终止液：称，用水定容到100ml。9)考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G25010mg,95%乙醇5m1,H3PO410ml，定容至l00ml，过滤后4保存。10)mg/mlBSA：20mgBSA，用GUS提取缓冲液定容至20ml。植物总蛋白的提取1)取新鲜的植物组织100mg左右，用液氮将生物材料急速冷冻，然后采用液氮研磨的方式在研钵里磨碎组织。如果不立即研磨，可以先将液氮冷冻处理的植物组织储存于-80冰箱。2)将研磨破碎的组织转到Ep管里，并立即加入1ml的GUS提取缓冲液，充分混匀。3)12,000rpm,4离心5min，将上清转至另一洁净的Ep管，冰上放置待用。蛋白浓度的测定1)取7个Ep管，分别加入0l、2l、4l、8l、12l、16l、20l的BSA标准液，用水补至相同体积20l。加入980l的考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，冰上静置5min。用紫外分光光度计测定595nm处的吸收值。以蛋白浓度对吸收值A595做标准曲线。2)取待测蛋白样品10l，加10l水，加入980l的考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，冰上静置5min。用紫外分光光度计测定595nm处的吸收值。代入公式，求出蛋白样品的浓度。GUS表达水平的定量测定1)取100l蛋白上清，加入400l37预热的GUS提取缓冲液里，再加入500lMUG底物，37温浴。在0min、15min、30min、45min和60min分别取混合反应物200u1加入到800u1反应终止液，室温避光保存。2)用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，狭缝10nm时测定不同时间点的荧光强度值。3)以荧光强度值对反应时间作曲线，求出单位时间的荧光强度变化。4)用单位时间的荧光强度变化除以参加反应的蛋白量，求出单位质量的蛋白单位时间的荧光强度变化。文档中提及的产品，可以登录生物耗材网查询！1、对实验结果进行文字描述。2、根据你的实习谈(转载于:写论文网:gus报告基因检测)谈gus活性检测时应注意哪些问题。注意事项：用于染色的植物材料的制备方法要因涉及的特定组织和器官的不同而异。例如，拟南芥的根、花和叶片以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理而直接染色。但是像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶就必须在染色前切成薄片。当操作大的组织和样品时，可以选用真空渗入法来帮助底物和酶渗入细胞。3、gus基因为什么被称之为报告基因？在转基因应用中有哪些优缺点。报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。报告基因必须具备的条件：(1)已被克隆和全序列已测定;(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物;(3)报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好，表达产物能进行定量测定。(4)细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测。GUS活性检测优点在大多数植物组织中GUS活性的本底低；反应产物基本不扩散，在植物细胞内积累；通过简单的扩散或真空渗入，底物易被植物细胞吸收。GUS基因作为报告基因的优势：?GUS蛋白在植物细胞中稳定存在，对较高的温度和去污剂有一定的耐受性；检测方法简单，可定性或定量：使用X-Gal为底物，通过显色反应来观察；使用4-MU为底物，多数植物组织中GUS背景表达低，样品表达能够很好区分。反应以后生成荧光物质，通过相应的荧光检测仪来进行经确定量；缺点不适用于活体组织的观察；在GUS表达水平很高的组织中会发生无色反应产物渗漏的现象，但是可以通过在底物溶液中加入氧化剂氰化钾或亚铁氰化钾或者二者都加，来使这种渗漏减至最少。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。