为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划luciferase荧光素酶报告检测试剂盒,promega双荧光素酶报告基因分析转载请注明来自丁香园发布日期：XX-04-0810:59文章关键词：双荧光素酶基因表达报告基因检测1.介绍荧光素酶报告基因表达的转录调控常被用来研究培养细胞的生物学特性。荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的荧光素酶。Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。通常，报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，共转染的“对照”报告基因会作为内对照，为试验提供一基准线。实验报告基因经过内参照的处理可以减小细胞活性和转染效率对实验的影响，因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。实验中报告基因和对照基因的酶没有种源同源性，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物分别与检测试剂反应可以使灵敏度最大化。由于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于制药和生物技术产业中。双荧光素酶报告基因检测系统适配于各种培养哺乳细胞的培养基，如1640，MEM，DMEM，F12等。这些试剂与被动裂解液所附带的试剂盒，可以从Promega试剂盒中分开(转载于:写论文网:luciferase荧光素酶报告检测试剂盒,promega)，单独使用。具有超高灵敏度和超宽线性范围的Veritas?微孔板发光检测仪特别适合DLR报告基因检测系统，Veritas?软件中预装了DLR的检测程序使得安装更为方便，内置自动加样器使得应用更为简单。Veritas?微孔板发光检测仪使用荧光素酶检测试剂II(LARII)最低可以检测到1X10-19mol荧光素酶分子，使用Stop&Glo?试剂可以检测到1X10-18mol海肾荧光素酶分子，检测线性范围分别为8和6个数量级。所有的检测均采用纯化的重组萤火虫荧光素酶(E1701)和纯化的重组海肾荧光素酶。图13使用Promega公司Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统，萤火虫荧光素酶(1x10-19到1x10-11mol)和海肾荧光素酶(1x10-14mol)在Modulus?仪上测量结果。2.所需器材?Veritas?微孔板发光检测仪(P/N9100-002)?96孔白板(E&KScientificEK-25075)?Dual-LuciferaseReporter?荧光素酶检测系统(E1980)?P200移液器和枪头3.实验方案试剂制备荧光素酶检测缓冲液II和荧光素酶检测底物：使用所提供产品，20储存，可以稳定保存6个月，荧光素酶检测底物可以4保存1个月。将荧光素酶检测缓冲液II加入荧光素酶检测底物中，配制DLR工作液，颠倒混合，直到底物彻底溶解。配好试剂最好当天使用，也可以将配好试剂分装，-20C储存1月，-70储存1年。Stop&Glo?底物和Stop&Glo?底物缓冲液：使用所提供产品，20储存。Stop&Glo?底物溶解缓冲液：使用所提供产品，低于25储存。在玻璃管或者硅化聚丙烯酸树脂管中将50Stop&Glo?底物稀释成1Stop&Glo?工作液。颠倒混合，工作液最好当天使用，也可以将工作液分装，-20C储存2周。被动裂解缓冲液：用去离子水将5x被动裂解缓冲液稀释成1x的，低于25C保存。注：因为荧光素酶活性受温度影响，在定量发光检测过程中Dual-Luciferase?荧光素酶缓冲液II和Stop&Glo?缓冲液应始终保持室温。混合试剂冻存后再次使用，为确保试剂性能，应在低于25条件下溶解。溶解后充分混匀，最简单的方法是室温水浴溶解。仪器安装双击Veritas图标运行软件；从WelcometoVeritas对话框中点击RunPromegaProtocol；浏览DLR文件夹，选择合适的检测程序，例如DLR检测中使用的是单注射器那就选择DLRwithoneinjection.；点击Options选择需要检测的孔，默认值是预置了Promega操作方案的最佳测量值。但也可以根据自己需要在OtherOptions面板中进行检测时间，延迟时间和加样体积的调整。修改结束，点击ApplyChanges确认修改，或者点击SaveProtocolAs保存修改方案。另外也可以点击Options返回MainDialogBox；在MainDialogBox.中输入个人信息，例如Experiment,Operator,PlateNo.,andNotes。样品分析准备含有裂解细胞培养物的96孔板；注：为了保证数据良好的重现性。加入试剂前，室温下平衡细胞培养基；准备注射器。将注射器1进样口放入LARII，将注射器2进样口放入Stop&Glo?试剂瓶，在MainDialogBox上用Prime键对注射器进行初始化；注：不能混用注射器。Stop&Glo?试剂对萤火虫荧光素酶活性有猝灭作用。建议一个注射器专门吸入Stop&Glo?，另一个专门吸入LARII；样品板放入Veritas?微孔板发光检测仪中，点击“Start”开始检测。检测结束后，所有需要检测的样品检测结果会以Excel表格形式显示，如检测中遇到其他问题，请参考问题导读获取更多信息；检测结束就可以通过Excel进行数据分析；检测结束取出检测板。选择ReversePurge将管路中剩余试剂回收到试剂瓶，而后彻底清洗注射器。4.相关文献1.Ow,etal.(1986)Transientandstableexpressionofthefireflyluciferasegeneinplantcellsandtransgenicplants.Science234,8569.2.DeWet,etal.(1987)Fireflyluciferasegene:structureandexpressioninmammaliancells,Mol.Cell.Biol.7,72537.双荧光报告基因分析实验目的：研究转录因子的活性和调控元件的活性。实验原理：通过将感兴趣的目的基因转录调控元件构建到带荧光素酶的表达载体，如pGL3，构建成报告基因质粒，使这段DNA序列调控luciferase的转录。然后将报告基因质粒转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，并加入底物荧光素后，luciferase可以催化荧光素发出荧光，从而可以通过测量荧光值的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。为避免由于质粒转细胞时效率的差异而带来的误差，可以同时转入Renilla荧光素酶的报告基因质粒作为内参，即双荧光报告系统。该实验可以用于研究转录因子对promoter或enhancer序列的调控，也可以用于研究受体活性，细胞内信号通路，或者microRNA对基因表达的调控。实验过程：1质粒构建载体的选择常用的载体有pGL3系列，包括pGL3-basic(附图1a)，pGL3-promoter(附图1b)，pGL3-enhancer(附图1c)。如果要研究的序列是promoter，可选择将目的片段插入pGL3-enhancer载体；若要研究的序列是enhancer，则可选择pGL-promoter载体。抽提基因组DNA，并以基因组DNA为模板PCR，克隆目的片段，通过合适的酶切，插入载体，构建报告基因表达质粒。2转染将报告基因质粒和作为内参的Renilla以及待研究的转录因子的表达质粒共转染细胞，并根据需要刺激或处理细胞，24h-48h后收细胞。在共转染时，由于内参质粒Renilla有很强的promoter/enhancer，因此报告基因质粒:Renilla转染量一般为10：1到50：1。3Luciferase活性的测定细胞裂解试剂盒中提供的裂解液为5XPLB，使用前取1体积的PLB，加4体积的dH2O混匀。去掉细胞培养液，用PBS洗一遍以去掉残留的培液，加入1XPLB。并将培养板于摇床上室温摇15min，使细胞充分裂解。将细胞裂解液转移至ep管，1XXgX30sX4离心。上清中即含有fireflyluciferas和Renillaluciferase，用于测定酶活性；而沉淀为核蛋白，可用于westernblot检测转录因子的表达。LARII和Stop&GloLARII是fireflyluciferase的底物，在使用新的KIT时，将LARII溶解在LAIIbuffer中，并分装保存。Stop&Glo是Renillaluciferase的底物，同时能终止LARII的反应。在试剂盒中提供的是50XStop&Glosubstrate以及Stop&Globuffer。可以一次将substrate与buffer混匀，然后分装保存，也可以每次使用前取1体积的substrate，加入50体积的buffer。测定在指形管中加入40l的LARII，10l细胞裂解液，用枪头上下打匀2-3次，于发光仪中测量，读数，即为fireflyluciferase的值。每管依次测量完后，加入40lStop&Glo，再次测量读数，即为Renillaluciferase的值。数据的处理先计算出每管的fireflyluciferase/Renillaluciferase的比值，再以control组的比值为单位1，即可得到不同处理组或转染组的相对luciferase活性，也就是该处理组基因转录的调控的活性。实验相关试剂：Dual-Luciferase?ReporterAssaySystem(Promega,E1910orE1960)保存条件：5XPLB-20LARII分装后于-70避光保存Stop&Glo分装后于-70避光保存注意事项：为保证荧光素酶检测试剂的稳定性，可以采取适当分装后避光保存的方法，以避免反复冻融和长时间暴露于室温。为取得最佳测定效果，样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制在相同时间内。样品和测定试剂混合后，再进行测定。测定时间通常为10秒，根据情况也可以测定更长或更短时间，但是同一批样品最好使用相同的测定时间。由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达到室温后再进行测定。附录：pGL3图谱图1a图1b图1c双荧光素酶报告系统双荧光素酶报告基因测试结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。