为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划pcr基因扩增实验报告实验三PCR扩增姓名：李宗翰专业：环境工程学号：同组人姓名：刘雪飞一、实验目的复习PCR扩增的原理，熟悉PCR的操作流程。二、实验原理PCR，即聚合酶链式反应，是一项在体外、短时间内大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。以单链DNA为模板、4种dNTP为底物，在模板3末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸。多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。PCR包括三个过程：、变性：目的双链DNA片段在94下解链；、退火：两种寡核苷酸引物在适当温度(5060)下与模板上的目的序列通过氢键配对；、延伸：DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。三、实验仪器及材料PCR扩增仪，微量移液器，Tip头，薄壁管，离心管，TaqDNA聚合酶，dNTP，buffer，引物，16S全长DNA样本。四、实验步骤1、用微量移液器分别取194LddH2O、25LBuffe、10LdNTP、5L341FGC引物、5L534r引物及LTaqDNA聚合酶于离心管中，混合均匀后分装到9个薄壁管中，每支管加入24L混合液。2、向第18支薄壁管分别加入1L样品模板，第9支管加入1L无菌水做阴性对照。在薄壁管的盖子上写上组号及样品编号。3、将9支薄壁管放入PCR扩增仪中，设置好扩增条件：943min；9430s；5530s；7230s；725min；15。循环次数3040。设置好后启动扩增仪，开始扩增。4、将扩增的好的样品按下述步骤进行电泳实验：、取琼脂糖和20mlTAE于锥形瓶中，放置微波炉中加热2min左右，至混合液透明，取出室温下冷却。将混合液倒入FR-180E制胶器的槽中，插入孔刷，注意不要有气泡。冷却一段时间，等胶凝固。、取10(转载于:写论文网:pcr基因扩增实验报告)LLoadingBuffer染液，在铺平的塑料手套上均匀分成9份，再取4LPCR产物与染液混匀。将10L移液器调至6-7L，依次吸取上述混合液滴，分别加入到1-9号胶孔中，第10号胶孔中加入4L的DLXXTMDNAMaeker。、将胶整个放入装满TAE的电泳槽中，通100V电压。、电泳半小时左右，可明显看出染液移动。将胶至于分析仪器内，在紫外灯照射下，得到电泳图并拍照。五、实验结果与讨论1、此次实验结果是什么？所得到的实验结果该如何解释？答：此次实验结果如下图所示。图中，1-8号为待测样品，9号为阴性对照，10号为DNAMarker。从电泳结果可以看出，3-6号样品对应Marker的250bp左右处有明显的亮带，说明3-6号样品的PCR扩张很好。2号样品在250bp处条带较微弱，说明扩增效果不是很好。而1、7、8号样品，在250bp左右基本无亮带，说明扩增实验出错，可能是因为模板没取到或者移液器枪头在加样时未深入液面下加入而引起的。9号为阴性对照，在250bp处无亮带，说明效果良好，实验过程中无环境污染。2、实验过程中需要注意些什么细节？答：、无菌盒内的离心管和薄壁管应用带枪头的微量移液器挑出，防止污染盒内其他管。、配制反应体系时，由于不同样品除了模板不同，其余试剂的加入量均相同，所以可以先在离心管中配制总体系，混匀分装到薄壁管后，再向个管内加模板DNA。这种方法比较节约时间。、上述方法配制总体系时，应考虑取样损失及误差，多配一些。、用微量移液器移取液体时，由于移液量很少，所以每次应将枪头插至管底将液体打出。、PCR仪存在边缘效应，即样品板的周围即角落处受热较差，中间区域受热较好，所以当样品数目不多时，尽量放在样品板中间区域。3、通过这个实验你有什么收获？答：通过PCR扩增实验，我对PCR扩增理论有了更深入的认识，而且学到了配制反应体系时的很多细节。同时，我还学会了PCR扩增仪的参数设置及使用，通过老师的讲解，我还了解了PCR扩增仪的一些特殊模式，如touchdown以及分块设置退火温度等。六、思考题1、如果你的研究中要扩增大肠杆菌某个酶的基因，你如何进行相关实验？答：、现在NCBI数据库中找到大肠杆菌的全基因序列；、从全基因序列中找到需要扩增的那个酶的基因片段；、通过引物设计软件来设计PCR扩增所需的引物；、得到目的基因和引物后，通过常规PCR扩增实验来进行扩增。、扩增后结果可以通过电泳实验进行分析。2、一对引物序列为5-GCACTCCAGTCGACTCTACA-3和5-ACCAGTGTCGACACCGCTCA请计算它们的Tm值及选择合适的退火温度，如果按你算的退火温度做PCR时没有得到相应的产物，你怎么解决？答：对于引物序列5-GCACTCCAGTCGACTCTACA-3，Tm1=42=4*+2*=62对于引物序列5-ACCAGTGTCGACACCGCTCA，Tm2=42=4*+2*=64Tm1Tm2，则退火温度=Tm1-5=62-5=57。如果按照次退火温度没有得到相应的产物，可以做一个退火温度优化实验，即用touchdownPCR或分模块设置退火温度，看不同温度下的PCR扩增量，选择扩增最好的作为退火温度。PCR实验室开展可行性分析报告一、开展条件：1、场所：实验室分四个分区已建好。2、人员：本科室已有PCR国家资质证书人员两名。3、检测设备：待购。二、可开展项目：2.焦磷酸测序可开展项目三、实验室布局依据：卫生部颁发的临床基因扩增检验实验室管理暂行办法及医疗机构临床基因扩增管理法(卫办医政发XX194号)常见布局请见下图。四、市场预测：1.目前标本量：目前每天有10-15例HBV-DNA检测，HCV-RNA0-2例，HBVP区耐药基因测序0-1例，其他项目有待宣传开发。2.可开发潜力：PCR由于需较多手工操作，且操作流程多，对环境要求高，检测难度大导致很多小型医院无力开展，县城周边医院以及乡镇医院一般不会开展，社会效益显著，市场开发空间很大。由于医疗技术的发展，开展PCR及测序病人会逐年增加，已经越来越受到重视。五、可行性分析结论：综上所述，我院检验科已具备相应标本数量开展PCR，各项配置基本成熟，开展PCR项目可行。检验科XX-6-19实验三PCR基因扩增一、实验目的掌握PCR反应的基本原理与实验技术二、实验原理：PCR(PolymeraseChainReaction)-聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序列。其基本步骤是，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，DNA样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在dNTPs和Taq酶存在时，就可以合成模板DNA的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这种延伸变性退火延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。1变性：加热使模板DNA在高温下变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链.2退火：使溶液温度降至5060，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合.3延伸：溶液反应温度升至72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸，按53方向复制出互补DNA.上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2530个循环后DNA可扩增106109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。三、仪器、实验用品、试剂一、仪器二、试剂PCR仪电泳仪电泳槽紫外检测仪PCRBuffer冰箱微波炉离心机TAE(500ml)Ice琼脂糖TagdNTPs模板DNAPrimer1Primer2三、其它用品移液器PCR管()一次性手套:实验步骤1、PCR反应体系10xBf1xTag5u/DDNA-H2Oto25ul混匀，加石蜡油2、PCR反应程序94预变性5以下35cycle94变性50/55退火30s72延伸1-2min最后溴化乙锭溴酚蓝marker石蜡油Tip防护眼镜胶带四725min3、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果配制1琼脂糖凝胶，取10ul扩增产物电泳。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。