为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划western印迹,实验报告Western印迹法这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。仪器：高压锅、电动匀浆机、高速离心机、垂直板电泳转移装置、脱色摇床。试剂：单去污剂裂解液、分离胶、4浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、5XSDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、显影液、定影液、抗体、ECL化学发光试剂。杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，口罩，保鲜膜，X-光片夹，X-光片，计时器，吸水纸。试剂配制：母液/ml(200mmol/L)PMSFPMSF异丙醇10ml溶解后，20保存。10SDSSDS5g蒸馏水至50ml50水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。5mol/LNaF氟化钠氟化钠超纯水10ml溶解后，-20保存。100mmol/L激活矾酸钠偏矾酸钠超纯水8ml加浓盐酸调节pH至10，80左右热水浴至溶液无色，室温冷却，重调pH至10，重复热水浴和调整pH的操作至溶液保持无色，定容10ml，-20保存。/LTris?HClTris()超纯水8ml溶解后，用浓盐酸调pH至，最后用超纯水定容至10ml，高温灭菌后室温下保存。10过硫酸胺过硫酸胺超纯水溶解后，4保存，保存时间为2周。/LTris?HClTris()超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。/LTris?HClTris()超纯水8ml溶解后，用浓盐酸调pH至，最后用超纯水定容至10ml，高温灭菌后室温下保存。30Acr/Bic丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺超纯水至50ml37下溶解后，4保存。使用时恢复至室温且无沉淀。20Tween20TweenXXml蒸馏水至50mlTween20比较粘稠，需将大枪头前端剪掉，将吸口扩大，吸取和移液时应缓慢，避免液体挂壁，混匀后4保存。使用液单去污剂裂解液：1mol/LTris?10%SDS200mmol/LPMSF蒸馏水至50ml若检测磷酸化蛋白，需加入100ul5mol/LNaF和500ul100mmol/L激活矾酸钠，混匀后，4保存。G250考马斯亮蓝溶液考马斯亮蓝G250：甲醇：15ml乙酸：5ml蒸馏水至50ml溶解后，4保存。分离胶810%超纯水30Acr/mol/LTris?HCl10SDS100l100l10%AP100l100lTEMED4l4l加TEMED后，立即混匀即可灌胶。4浓缩胶超纯水30Acr/Bicmol/LTris?HCl10SDS30l10%AP30l12%100l100l4l15%100l100l4lTEMED3l加TEMED后，立即混匀即可灌胶。还原型5XSDS上样缓冲液mol/LTris?HCl二硫叔糖醇10%溴酚蓝甘油混匀后，分装于离心管中，4保存。电泳液缓冲液Tris甘氨酸蒸馏水至500ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用23次。转移缓冲液甘氨酸Tris甲醇200ml蒸馏水至1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用23次。Western印迹法这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、20低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。试剂：单去污剂裂解液、/LPBS()、10分离胶、4浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、4XSDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、封闭液、PBST、PBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、抗体、化学发光试剂。杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘，X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：母液一SDS-PAGE电泳10SDSSDS10g蒸馏水至100ml50水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10过硫酸胺过硫酸胺超纯水溶解后，4保存，保存时间为1周。/LTrisHClTris()超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。/LTrisHClTris()超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。40Acr/Bic丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺1g超纯水至100ml37下溶解后，4保存。使用时恢复至室温且无沉淀。使用液单去污剂裂解液：1mol/LTrisHClNaClTritonX100蒸馏水至50ml混匀后，4保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100g/ml。PBSNa2HPO4NaCl8g蒸馏水至800ml用浓盐酸调PH至定容至1LPBST:及含%-(%)TWEEN-20的PBS封闭液:及含5%脱脂奶粉的PBSTG250考马斯亮蓝溶液考马斯亮蓝G250：100mg95乙醇：50ml磷酸：100ml蒸馏水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4保存。15分离胶和5浓缩校15分离胶5浓缩胶超纯水920ml980ml40Acr/Bic2ml267mlmol/LTrisHCl1mlmol/LTrisHCl300ml10SDS40l17l10%AP40l17lTEMED4l加TEMED后，立即混匀即可灌胶。4样品缓冲液还原型(10ml):Trisg-巯基乙醇2mlSDSg溴酚兰g甘油4ml浓盐酸189l加超纯水定容至10ml。用微量离心管分装后，冻存。非还原型：TrisgSDSg溴酚兰g甘油4ml浓盐酸189l加超纯水定容至10ml。用微量离心管分装后，冻存。混匀后，分装于离心管中，4保存。电泳液缓冲液Tris甘氨酸SDS1g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用35次。转移缓冲液甘氨酸Tris甲醇200ml蒸馏水至1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用35次。封闭液脱脂奶粉5gPBST100ml溶解后4保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。洗脱抗体缓冲液:PBST冰乙酸硼酸钾明矾15g加水定容至1000ml，室温保存抗体用PBST稀释至一定浓度使用，每张膜需DAB显色试剂盒购自北京中彬金桥公司，分A,B和C三种试剂。操作步骤：蛋白样品制备单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液。2、每瓶细胞加3ml4预冷的PBS。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3、按1ml裂解液加10lPMSF，摇匀置于冰上。4、每瓶细胞加400l含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至离心管中。6、于4下1XXrpm离心5min。7、将离心后的上清分装转移倒的离心管中放于20保存。组织中总蛋白的提取：1、将少量组织块置于12ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。2、加400l单去污剂裂解液裂于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。4、裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至离心管中，然后在4下1XXrpm离心5min，取上清分装于离心管中并置于20保存。加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：1、将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。2、弃上清，加入4mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。4、混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计上比色分析。5、检测样品蛋白含量1、取足量的离心管，每管加入4储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。2、取一管考马斯亮蓝加/LNaCl溶液100l，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。3、弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次，再用无菌水洗一次。4、取一管考马斯亮蓝加95l/LNaClNaCl溶液和5l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5l样品含的蛋白量。SDS