欢迎大家参加 我的开题报告,氨基酸螯合锌和维生素E互作对肉仔鸡生长、免疫和抗氧化功能的影响,一、论文选题意义 1、科学和实践意义 2、国内外研究动态 3、创新和特色,1 科学和实践意义 随着畜牧业的发展，饲料中矿物元素和维生素添加剂的应用日益普遍，与此同时，由于不了解矿物元素与维生素互作而产生的资源浪费、环境污染等问题也日益严重，因此，对矿物元素与维生素互作的研究具有很重要的意义。 VE和微量元素Zn作为肉鸡维持健康、正常生长发育、免疫所必需的微量营养成分，在肉鸡生产中起着极其重要的作用。但是以前的研究只注重于单一养分的添加效果的探讨，对于锌和VE互作在肉鸡生长、免疫中作用的研究很少，而氨基酸螯合锌与VE互作的报道更少，所以，我们有必要进行更进一步的研究。 本试验通过给予肉仔鸡不同剂量的氨基酸螯合锌和VE，探讨锌与VE互作对肉鸡生长、免疫和抗氧化功能的影响，并根据生长、免疫等指标确定Zn-AA与VE同时添加时的适宜量，为今后生产中进一步合理利用氨基酸螯合锌和VE，以及肉仔鸡日粮的合理配制提供科学依据。,2 国内外研究动态 VE对生长、免疫抗氧化功能的研究进展,许多研究均已证明VE有促生长的作用，给肉鸡日粮中添加VE可以提高日增重和料肉比，从而提高其生产性能（Morrissey等1997；蔺志刚等2004；李绍钰等2005）。 VE也可以影响免疫系统(Meydani等1989)。一方面，可以增强机体的体液免疫（Morandi等1993）。另一方面，也提高淋巴细胞的转化率和数量，提高细胞免疫能力（C. Lauridsen等2005；孙尼，2004）。 VE还可以提高机体抗氧化力。机体缺乏VE时，不仅会干扰肉鸡正常的免疫反应Gore等1997；王文君2002)，而且机体的抗氧化能力也下降了（ J. E. Oldfield等2003； T. L. Toepfer-Berg等2004）。,氨基酸螯合锌对生长、免疫、抗氧化研究进展,肉鸡日粮中添加蛋氨酸锌时，以增重、采食量和饲料转化率为评价指标，能促进生长，而且添加效果在前、中期优于后期（Aeda等2002；KSahin等2005) 。 氨酸螯合锌在增强肉鸡免疫和抗应激方面也有一定的作用（Dardeune等 1993；KSahin2005）一方面主要是通过提高血清中IgG含量，增强机体的体液免疫功能(Ahn等1998)，另一方面，也可以提高淋巴细胞的免疫活性，从而提高细胞免疫力（Kidd 1992，1994），降低发病率和死亡率(Dudley-cash 1997；Christ等2000）。 肉鸡缺锌，肝脏、脾脏、法氏囊和胸腺中Cu,Zn-SOD、GSH-Px的活性明显下降(张日俊1996)、机体抗氧化力下降（Salgueiro2000；Zago等2001），血清锌含量降低、AKP活性降低(Kraus等1997)、MDA含量显著升高 (周丽英等1999)。但是日粮高锌可使雏鸡免疫功能受损(崔恒敏等2005)。,锌和VE对生长、免疫抗氧化研究进展,Dove和Evans(1981)报道畜禽饲料中添加高水平的Zn、Mn可增加VE的损失。 Sahin和Kucuk（2003）报道猪饲料中添加VE和锌对环境应激有改善作用。 孙尼（2004）认为饲料中含高水平的锌与铜可增加鸡对缺乏维生素E症状的易感性。 张维睿等(2005)认为微量元素氨基酸螯合物可防止维生素的破坏。,3 创新和特色,提出锌（氨基酸螯合锌）和VE互作对肉仔鸡生长性能、免疫机能和抗氧化功能的影响。 比较肉仔鸡不同生长阶段（0-3w，4-7w），锌和VE互作对其生长性能、免疫机能和抗氧化功能的影响。 了解微量元素锌与VE的协同或颉抗作用。,二、研究内容、预期达到的目标及拟解决 的关键问题 1、研究内容及预期达到的目标 2、拟解决的关键问题,1 研究内容及预期达到的目标,本研究以0-7周龄肉仔鸡为研究对象，通过饲养试验，探讨氨基酸螯合锌与VE互作对肉仔鸡生长性能、免疫和抗氧化功能的影响，为现今生产中提供理论依据。 本研究以0-7周龄肉仔鸡为研究对象，通过同时添加氨基酸螯合锌和VE，探讨锌和VE之间是否存在颉抗或协同。 本研究通过两个实验阶段（0-3w，4-7w），比较不同阶段锌和VE互作对肉仔鸡生长、免疫和抗氧化功能的影响。 本研究以0-7周龄肉仔鸡为研究对象，根据生产性能免疫机能和抗氧化指标结果，筛选出维持肉仔鸡生长性能以及免疫功能和抗氧化功能最佳的VE和锌水平。,2 拟解决的关键问题,日粮中氨基酸螯合锌与VE互作对肉仔鸡生长性能的影响； 日粮中氨基酸螯合锌与VE互作对肉仔鸡免疫功能的影响； 日粮中氨基酸螯合锌与VE互作对肉仔鸡抗氧化功能的影响。,三、研究方法和技术路线 1. 拟采取的研究实验方法、步骤、技术路线及可行性论证 2. 研究工作的总体安排及进度,1. 拟采取的研究实验方法、步骤、技术路线及可行性论证 1.1 实验方法及实验设计 1.2 饲养管理 1.3 测定指标及方法 1.4 实验步骤 1.5技术路线及可行性论证,1.1 实验方法及实验设计 本试验选用1日龄健康的艾维茵肉仔鸡300只（公母各半）采用33（ZnVE）二因子完全随机化设计，随机分为10个处理，每个处理3个重复，每个重复10只鸡。试验期为期7周。试验日粮为玉米一豆粕型日粮，参照NRC（1998）肉鸡营养标准。 对照组为基础日粮，试验组日粮是根据基础日粮中维生素和微量元素的含量和以前有于添加量的研究结果，在基础日粮基础上添加： 蛋氨酸锌水平为10、50、100mg/kg（以锌计）；维生素E为5、10、100IU/kg（具体设计见表1）。,表1试验设计,注：锌为蛋氨酸螯合锌，VE为VE醋酸酯,1.2 饲养管理 试验鸡，按照该品种鸡管理手册管理。保证自由采食与饮水。 1.3 测定指标及方法 （1）生长性能有关指标：各重复组分别在3、5、6和7周龄末测定两阶段鸡体重，统计耗料量，和各组鸡死亡数，计算增重、料肉比。 （2）T淋巴细胞百分数：采用-醋酸萘酯染色法1 。 （3）免疫器官指数（g/kg）=免疫器官鲜重/体重,（4） 淋巴细胞转化率：采用淋巴细胞转化实验2。 （5）NDV抗体效价：采用酶联免疫吸附试验3测定。 （6）血清铜锌超氧化物歧化酶（Cu,ZnSOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）血清铜蓝蛋白(CP) 和血清丙二醛（MDA）都由南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定。 （7）组织器官锌浓度 组织器官锌浓度：准确称取烘干粉碎后样品2.0000克于30毫升坩埚中，在电炉上炭化至无烟，冷却，然后置于500-550高温电炉中灰化8小时，冷却后，加1mol/L的硝酸2ml35烘箱过夜，再转移到50ml容量瓶中，定容，用原子吸收分光光度计测定。,1.4实验步骤 试验期49天。分两个阶段，第一阶段为03周龄，第二阶段为47周龄。分别在7、14日龄接种NDV疫苗，并检测相应抗体效价。 1.4.1样品的采集和制备 分别在3、5、6、7w末采集（公母比例相同）血样。从每个重复内随机抽取接近平均体重的鸡各两只，心脏采血。制备全血和血清。最后一次采血并称重后，将鸡屠宰，去毛，称屠体重，然后将法氏囊、胸腺、脾脏分别称重。 1.4.2 数据统计分析 试验所有数据均采用SAS统计软件中（ANOVA）进行方差分析，多重比较用邓肯氏法(DUNCAN)。 1.5技术路线及可行性论证,饲养试验：试验期7周，分两个阶段，03周龄和47周龄,第21、35、42、49日龄从每组各重复固定2只鸡，空腹心脏采血。,第21、35、42、49日龄分别从每个重复选取两只鸡，取胸腺、法氏囊和脾脏。并称重与体重作比较。,测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性,用于测定碱性磷酸酶(AKP)、血清铜蓝蛋白(CP) ，丙二醛（MDA），血清铜锌超氧化物歧化酶（Cu,ZnSOD）的含量,分别在第7、14日龄接种NDV疫苗。,用酶联免疫方法测定NDV抗体效价。,用-乙酸萘酯酶染色法和体内诱导法分别测定淋巴细胞百分数和淋巴细胞转化率。,分离 血清,加2%肝素钠抗凝全血,2、研究工作的总体安排及进度 2005.72006.3 搜集并整理资料，准备试验的前期工作； 2006.42007.1 操作饲养试验，并检测各项指标； 2007.22007.5 统计分析试验数据，总结试验结果并撰写论文,四、研究基础和已具备的工作条件 1、与本项目有关的研究基础，已发表的论文 本课题是在查阅了大量有关氨基酸螯合锌、维生素E及其相互关系方面的中外文资料，借鉴前人研究经验，熟练掌握相关指标检测分析技术的基础上提出的。,2、已有的主要仪器设备，尚缺的仪器设备及解决途径 本试验可利用我校动物科技学院实验室及牧站实验室，本研究所需的主要仪器设备有酶联免疫检测仪、分光光度计等，购买雏鸡和配料等问题可以解决。,五、本研究项目经费预算（单位：万元） 1. 科研业务费：0.1 2. 实验材料费：试验鸡及养殖费：0.4 药品费： 0.3 共计： 0.8,谢谢大家,1 一醋酸萘酯染色法 1、基本原理： T淋巴细胞的胞浆内存在着酸性一醋酸萘酯酶，在弱酸性条件下，能使底物醋酸萘酯水解，产生醋酸离子和一萘酚。其中一萘酚与六偶氮副品红偶连，生成不溶性的红色沉淀物，沉积在T淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位。经甲基绿复染后，反应颗粒变暗而呈深紫红色。 2、所需试剂 4%副品红盐酸溶液；4%亚硝酸钠水溶液(现用现配)；2%一乙酸萘酯乙二醇甲醚溶液(现用现配)；福尔马林一丙酮固定液；PH7.6磷酸盐缓冲液(PBS)；0.5%孔雀绿染色液；孵育液配制(现用现配)。 3、操作步骤 静脉取血，载玻片上涂血片2张，晾干，将血片置冷的福尔马林一丙酮固定液中，4下固定lmin。取出血片用自来水冲洗3min，用蒸馏水冲掉自来水，室温干燥；将血片放入孵育液中，37孵育1.5hr，取出血片，水洗3min，用双馏水冲去沉淀物，孔雀绿染色液复染lmin，自来水和双馏水先后冲洗，晾干，油镜观察，计数100个淋巴细胞，求出ANAE阳性细胞百分比。,2淋巴细胞转化试验 淋巴细胞转化是体外检测T淋巴细胞功能的一种方法。取肝素抗凝血0.lml，无菌加入1.8ml的RPM11640完全培养液(含20%小牛血清，青霉素、链霉素各100ug/m1，30.0g/lL-谷氨酸lml，PH7.6)，再加入0.lmlPHA，置373天，每天摇动一次。取出后吸出大部分上清夜，加入8.5g/lNH4Cl4ml，混匀后置37水浴10分钟。2500离心l0分钟，弃上清，沉淀后加5ml固定液(甲醇：冰醋酸=9:1)，室温中l0分钟后离心弃上清，留0.2ml沉淀。轻轻混匀后滴加于一洁净玻片上，使其均匀铺开。自然干燥后用Giemsa染液染色，油镜一下观察200个淋巴细胞，计算其母细胞转化率。,3酶联免疫吸附方法 一、主要仪器 酶联免疫检测仪(Bio550) 酶标板 (96孔) 微量注射器。 二、主要试剂 HRP标记羊抗兔Ig G(1:1 000，国产)；标准牛IgG；兔抗牛血清（1：32）； 碳酸盐一重碳酸盐缓冲液(pH= 9.6)；柠檬酸盐缓冲液(pH =4.0)； 磷酸盐缓冲液PBS ；ELISA缓冲液：PBS + 1 % BSA ；清洗液：PBS+0 .05%Tween 20；底物溶液贮液为20 mg/ml ABTS，使用时用柠檬酸盐缓冲液稀释20倍，再用等体积的0.3%H2O稀释；终止液。 三、操作步骤 1. 包被抗原和洗涤 2. 加封闭液200微升，37放置一小时。洗涤(同2 ). 3 . 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释, 每孔200微升。同时作稀释液对照。 37放置2小时。洗涤(同2 ). 4. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37 1小时，洗涤(同2 ) 。 5. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10-15