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KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/碱性成纤维细胞因子在博莱霉素致肺纤维化肺血管损伤中的作用作者:刘华,陈利萍,朱新菊,贺永锋,赵杰,刘新作者单位:北京市公安局,北京 ;西安交通大学医学院法医系,陕西西安 ;镇江市公安局刑侦支队,江苏镇江 ;陕西省公安厅刑侦局,陕西西安【摘要】 目的 探讨碱性成纤维细胞因子(bFGF)在博莱霉素(BLM)致大鼠肺纤维化肺组织中的表达及其在肺血管损伤中的作用。方法 于大鼠气管内注射 BLM 以复制其肺纤维化模型,应用bFGF 多克隆抗体按 SABC 法行免疫组织化学染色,定量图像分析。结果 BLM 组动物支气管上皮细胞胞浆内、支气管和肺小动脉肌层以及肺泡巨噬细胞胞浆内可见较多棕黄色细颗粒状 bFGF 阳性表达产物,显著高于对照组(P0.05)。结论 在 BLM 致大鼠肺纤维化过程中 bFGF 表达上调,提示 bFGF 可能参与肺间质纤维化的发病过程。【关键词】 碱性成纤维细胞因子,博莱霉素,肺纤维化;血管损害;免疫组化ABSTRACT: Objective To explore the expression of basic fibroblast growth factor(bFGF) in pulmonary tissues of rats with bleomycin induced pulmonary fibrosis and the role of bFGF in vascular injury. Methods Pulmonary fibrosis was induced in rats by intratracheal injection of bleomycin(BLM). Lung expression of bFGF proteins was KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/assessed by SABC immunohistochemistry using bFGF monoclonal antibody and quantitative image analysis. Results The expression of bFGF in the lung tissues of BLM group was mainly distributed in bronchiole epithelial cells, muscular layers of bronchi and arterioles, and alveolar macrophage. It was higher than that in control group, with significant difference (P0.05). Conclusion The up regulation expression of bFGF in the BLM induced pulmonary fibrosis indicates that it directly participates in the process of pulmonary fibrosis.KEY WORDS: basic fibroblast growth factor (bFGF); bleomycin; pulmonary fibrosis; vascular injury; immunohistochemical method肺间质纤维化是一种病因各异、表现相似的疾病谱,是各种弥漫型肺间质疾病的最终表现形式,其主要病理特点是肺内成纤维细胞过度增殖和细胞外基质的过多聚集。肺间质纤维化一旦形成,将不可逆地导致严重的甚至致命的呼吸循环功能障碍。有关肺纤维化发生的机理已有了较为深入的研究,但纤维化过程中肺组织、血管的损伤机制尚不清楚。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)具有强大的促进细胞分裂增殖的作用1,是各种原因所致肺间质纤维化形成机制研究的重点对象。在本研究中,我们应用免疫组织化学技术结合图像分析,观察博莱霉素(bleomycin, BLM)致大鼠肺组织纤维化中肺组织 bFGF 的表达,从血管损伤方面探讨 bFGF 在 BLM 致肺间质纤维化的发病机制中的作用。KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/1 材料与方法1.1 实验动物及分组 体重 200-250g 的健康雌性 Wistar 大鼠 60 只,由西安交通大学医学院实验动物中心提供。随机分为BLM 组和生理盐水对照组,每组 30 只。1.2 肺纤维化模型的建立 BLM 组用戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,在无菌操作下作颈部正中切口,逐层暴露气管,用 lmL 注射器( 前带 7 号针头)抽取含 BLM(5mg/kg)的生理盐水 0.2-0.3mL,经两气管软骨环间隙朝向心端刺入气管。将大鼠直立,继续朝向心端进针约 1.0-1.5cm,回抽出空气并无阻力后,将药液注入气管,旋转动物,使药液在肺内分布充分、均匀。缝合伤口。对照组,在同样条件下,向气管内注入相同体积的生理盐水。两组动物分别于气管内灌注后 3、7、14、21、28d 随机处死动物各 6 只。1.3 肺组织病理标本的制作 戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。常规消毒后开胸,暴露心肺,于右心室插入与输液器相连的针头,左心耳剪一约 2mm 左右切口,向右心室内灌注 PBS(pH 7.4)冲洗血管至双肺呈白色胶冻状。结扎左主支气管,经气管向右肺注入 40g/L 多聚甲醛 6mL,使胸膜展开,结扎气管后右肺置 40g/L多聚甲醛中固定。上、中、下叶各取材一块,常规脱水,石蜡包埋,切片(5m)。1.4 bFGF 免疫组织化学染色 采用免疫组化 SABC 法,bFGF 多克隆抗体购自博士德公司。免疫组织化学染色按试剂盒说明书进行:石蜡切片常规脱蜡、脱水;3%(体积分数)H2O2( 蒸馏水KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/新鲜配制)室温 5min 以灭活内源性酶,蒸馏水洗,3min3; 复合消化液 1min,蒸馏水洗, 3min3;正常工作血清封闭液室温10min,甩去多余液体,不洗 ;兔抗大鼠 bFGF 多克隆抗体(IgG 型) ,经预试验选择工作浓度为 1100,4过夜,0.01mol/L PBS 洗,3min3;生物素化山羊抗兔 IgG 抗体,37 20min,0.01mol/L PBS 洗,3min 3。SABC 试剂 37 20min,0.01mol/L PBS 洗,5min4;DBA 室温显色,蒸馏水洗;苏木素复染,脱水、透明、封片。各组均设阴性对照切片,以 0.01mol/L PBS 代替一抗。1.5 bFGF 的定量分析 使用北京航空彩色病理图像分析系统。将待测切片放置在连接计算机的显微镜下观察。每组 6 只动物,每只动物取 3 张组织切片,每张切片取 5 个视野(上、中、下、左、右) ,于高倍镜下(400) 检测 bFGF 平均吸光度值 (A)。1.6 统计学处理 采用 SPSS12.0 统计分析软件,各组间进行 t 检验和相关分析,以 P0.05 为有统计学意义。2 结果2.1 肺组织的病理变化 大体标本:对照组双肺呈粉红色,表面光滑,开胸后迅速萎陷;BLM 组可见双肺表面灶状分布的出血点,随时间延长上述改变由新鲜变为陈旧,肺表面可见点状、索条状淡黄色凹陷,开胸后肺组织萎陷不明显。组织学观察:NS 组各观察点均无明显改变。BLM 组第 3 天可见肺泡壁水肿,炎性细胞渗出增多;第 7 天炎症更明显,为大片状炎性细胞浸润,成纤维细胞增多;第 14 天时肺泡炎仍较重,成纤维细胞进一步增多;第 21-28 天部分肺KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/泡结构消失,局灶性纤维化和纤维结节形成,炎性细胞渗出有所减少。2.2 bFGF 在肺组织内的分布 各组大鼠肺组织 bFGF 多克隆抗体免疫组化染色阳性表达产物为棕黄色细颗粒状。两组动物的空白对照切片均未见阳性表达。NS 组大鼠肺组织切片内见 bFGF 弱阳性表达,主要分布于支气管上皮细胞胞浆内,支气管和肺小动脉的肌层也有弱阳性表达(图 1)。BLM 组动物上述部位 bFGF 的阳性表达明显增强,支气管上皮细胞胞浆内、支气管和肺小动脉的肌层以及肺泡巨噬细胞胞浆内均可见较多棕黄色颗粒状强阳性表达产物。2.3 bFGF 表达的定量检测 定量分析结果显示,支气管上皮细胞、肺血管的肌层以及肺泡巨噬细胞胞浆内 bFGF 的表达于气管内灌注 BLM 后第 7 天即开始增高,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05),第 28 天时仍高于对照组 (P0.05)。3 讨论肺纤维化是以肺内成纤维细胞过度增殖和细胞外基质的过多聚集,导致肺顺应性降低、容量减少,最终引起呼吸衰竭为特征的一组慢性病变。在肺纤维化过程中,随着肺组织损伤的发生,必然启动组织修复的一系复杂的调节过程,其中血管的修复和新生起着重要作用。研究表明,许多在血管新生中起重要作用的细胞因子在纤维化的发生发展过程中同样起着关键作用2 3。以往的研究资料表明在特发性肺间质纤维化、结节病、铍尘肺、氧中毒等多种疾病中均可见肺组织的 bFGF 表达上调,可能参与了其肺间质纤维化KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/的发病过程4。成纤维细胞生长因子(FGF)是一种结构相关的多肽生长因子家族,具有很强的促细胞生长作用,能影响多种细胞的生长、分化及功能。根据其等电点的不同,FGF 分为酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。资料表明,bFGF 有很强的促血管壁细胞增生的作用,在体内和体外均能明显促进新生血管形成。将含有 bFGF 的海绵植入大鼠的皮下或腹腔 ,确认有强有力的血管新生作用5。bFGF 在慢性阻塞性肺疾病气道重构和肺小动脉重建中也起着重要作用6。病理学研究表明,BLM 诱导的肺纤维化早期变化以肺泡炎为主要特征7 8。肺泡炎又与血管损伤有密切关系,BLM 作用后第 3 天电镜下即可观察到肺泡壁基底膜水肿、裸露、断裂,血管内皮细胞受损9。在本实验中,BLM 作用后第 3 天即见炎症细胞渗出增多,至第 7 天炎症更加明显。伴随血管内皮的损伤,必然启动一系列的血管修复机制。实验表明,外源性 bFGF 对受损血管的内皮细胞、平滑肌细胞有促有丝分裂作用。bFGF 对新生血管形成过程中多个环节均有促进作用,可趋化血管内膜的各类细胞,并诱导这些细胞表达组织重建所需的血浆酶原激活剂、胶原酶、蛋白水解酶等。这些酶类通过促使血管内皮基膜降解和刺激内膜各类细胞的增值与迁移,诱导血管内皮细胞长入胶原基质中形成管腔,并促进神经元与新生血管共同生长。本组实验结果显示,各组空白对照均无 bFGF 表达;对照组肺组织中 bFGF 呈低水平表达,主要表达于大气道壁和血管壁的平滑肌细胞;BLM 组在博莱霉素给药后 7d,bFGF 表达提高,至给药后 28d,仍有较高水平的表KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/达。BLM 给药后 7d,组织炎症最为明显,导致血管内皮损伤启动血管修复机制,bFGF 作为重要的血管活性物质 ,它的表达增高,作用于受损血管的内皮细胞、平滑肌细胞,促进血管新生。bFGF 对成纤维细胞亦具有强烈的趋化和增生刺激作用,这说明 bFGF 在在肺纤维化过程中具有重要作用。本研究通过对 bFGF 表达水平的检测,从血管损伤方面进一步阐述了肺间质纤维化的发生机制,为探讨肺纤维化的治疗提供了新方向。【参考文献】1Inoue Y, King
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