病毒性疾病标本采集、保存与检测 中国疾控中心病毒病所 王世文,采样前准备 包括各种采样现场需要的器械、耗材，无菌标本容器，采样后处理试剂，低温保存设备和个人防护装备，以及各种采样表格等,明确采样要求 针对不同事件的处置，采样目的、对象、标本种类各不相同，采样人员需要根据事件或疫情的特点，制定出详细的、有针对性的采样工作程序。内容主要包括：采样目的、对象、时间、部位、标本量、无菌要求（一般不需要）、标本保存与运输条件等，并需根据现场实际情况进行必要的调整,现场采样,标本采集应严格按照相关生物安全规定进行 保护医务和疾控人员,现场采样,血标本-血清 需采集多份血清标本 至少 急性期（发病7d内或发现时） 恢复期（与急性期间隔2-3周） 分别采集外周静脉血各5ml6ml，分离后的血清分装于3个塑料螺口血清管中 一份0.5ml左右，用于即将开始的检测 一份检测备份 一份留存,监测病种,现场采样,呼吸道标本 上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、痰液 下呼吸道标本：包括呼吸道抽取物、支气管灌洗液、胸水、肺组织活检标本 消化道标本 患者的粪便和肛拭子 要求：发病早期即开始采集，根据病程决定采集的频次，采好的标本分装于3个螺口塑料试管中,现场采样培训,现场采样,其它人体标本 包括脑脊液、疱疹液、淋巴结穿刺液等 采集好的标本分装于3个螺口塑料试管中,尸体解剖 不明原因疾病的死亡病例 尽可能采集死亡病例的所有组织器官 应根据疾病的临床表现，采集与疾病有关的重点组织器官标本（如肺、肝穿刺） 做病原学研究的组织标本采集得越早越好，疑似病毒性疾病的标本采集时间最好不超过死后6h 病理检查的标本不超过24h 同种组织每一部位至少采集3份标本，1份用于病原学研究（无菌采集），1份用于病理学研究（固定于福尔马林中），1份用于电镜检查（固定于电镜标本保存液中） 重要的组织器官应多部位同时采集标本,现场采样,媒介和动物标本 疑似虫媒传染病或动物源性传染病,现场采样,现场采样,做好样品标记 样品标记非常关键，是所有标本辨识的唯一标志，绝对不能出现任何错误 标本采集过程中，应保证采样记录表登记、采样日志记录与样品标记同时进行，并确保编号一一对应 样品编号需要在标本容器表面与容器盖顶上同时进行标记，避免容器与盖子错配，造成标本的交叉污染,发热伴血小板减少综合征监测,采集标本 血清 血凝块 血浆 白细胞,背景,2004年以来，浙江、安徽、江苏、山东、河南、湖北等省相继报告一些以发热伴血小板减少为主要表现的感染性疾病病例，其中少数重症患者可因多脏器衰竭损害，救治无效死亡 2004年，浙江、安徽等省局部地区发现发热、血小板减少散发病例，实际发病数不详，病因不明 2005年5月，江苏报告发热、血小板减少散发病例，实际发病数不详，病因不明 2005年9月，湖北省咸宁市报告6例聚集性不明原因发热病例，首发病例死亡，5为续发病例为首发病例的亲属，发病前均有在护理首发病例过程中接触首发病例呕出血液史。该起疫情也未能明确病原,背景,2006年11月，安徽省广德县报告10例聚集性发热伴血小板减少的病例，首发病例死亡，诊断为“疑似流行性出血热”,在其诊疗和护理的医务人员和家属接触者中出现9例病例，其中医务人员4例，家属5例。续发病例具有首发患者呕出血液和其他分泌物暴露史,经检测确诊为嗜吞噬细胞无形体病。这是我国首次确认人粒细胞无形体病 此后山东、安徽、河南等省也相继有疑似无形体病报告,Zhang Lijuan, et al. JAMA 2008, 300(19): 2263-2270,背景,2007年3-9月，河南省信阳市及其周边地区共报告79例疑似无形体病病例，死亡10例。针对该起疫情的病原学检测未能做出明确结论 2009年3-10月，湖北随州、黄冈等6个市共报告疑似无形体病病例93例，6例死亡（其中随州58例、黄冈18例）。经实验室检测，嗜吞噬细胞无形体均为阴性，1例病例查菲埃里克体阳性,背景,疾病特点 多为急性起病，多数患者伴有乏力、纳差、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状，部分患者出现黑便、牙龈出血、皮肤瘀点或瘀斑、眼结膜充血等出血症状。绝大多数患者白血病不高或降低、血小板减少，部分患者谷丙/谷草转氨酶升高、尿蛋白阳性。 病例均发生在丘陵地区，发病时间集中在5-10月。男性多于女性，且多为农民。20岁以下及80岁以上人群未见发病。,背景,病毒 细菌 立克次体 埃里克体 无形体,发热伴血小板减少综合征监测,采集标本 血清 血凝块 血浆 白细胞,标本保存,血清可在4存放3d、-20以下长期保存。用于病毒等病原分离和核酸检测的标本应尽快进行检测 24h内能检测的标本可置于4保存，24h内无法检测的标本则应置于-70或以下保存,标本运送,要严格做到生物安全 依据病因分析的病原体分类，如果为高致病性病原微生物，应严格按照病原微生物实验室生物安全管理条例（国务院424号令）和可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部第45号令）、人间传染的病原微生物名录等有关规定执行,标本检测与解释,标本的预处理 血清灭活 病毒性疾病的实验室检测方法可分为三类，即直接检测、间接检测和血清学检测,标本检测与解释,直接检测 直接检测临床标本中病毒颗粒、病毒抗原或病毒核酸 方法 电镜/免疫电镜检测、组织中包涵体检查、IFA/ELISA检测抗原、病毒核酸/基因组检测等 特点 一般在标本采集、送达的当天或次日就可得到结果，这对于需要根据实验室检测结果进行临床处置和尽早采取防控措施极为重要，但对标本的要求也较高，病变部位标本的阳性结果比其它部位的阳性结果诊断意义大得多,标本检测与解释,标本检测与解释,抗原检测 常用方法 免疫荧光试验（IF）、双抗体夹心ELISA法等 IF 优点：快速、易于操作 缺点：敏感性和特异性较低 IF试验对标本质量的要求较高 由于在结果判定时有一定主观性，需要检测人员具有较丰富的经验 双抗体夹心ELISA法 比IF复杂，但敏感性和特异性较高,标本检测与解释,核酸检测已经成为病毒性疾病实验室诊断中最常用的方法，发挥着越来越重要的作用， 核酸检测的方法多种多样，主要包括两类 不进行病毒核酸扩增的探针杂交法 核酸扩增的方法：PCR/RT-PCR/Real-time PCR）、基于核酸序列的扩增（如NASBA）,标本检测与解释,特点 敏感性极高、简便、快速，Real-time PCR还可以定量检测 高通量、多病原快速检测,标本检测与解释,间接检测病毒分离 细胞培养 原代细胞培养 传代细胞培养 鸡胚接种 尿囊腔 卵黄囊 . 动物接种,标本检测与解释,血清学检测 在病毒学实验室中使用最为普遍，如急性期血清中特异性IgM、IgA、IgG检测等 血清学检测的方法多种多样，多数病毒性感染通常都可以采用血清学检测的方法加以诊断 双抗原夹心ELISA法、间接ELISA、单扩溶血试验（SRH）、中和试验（NT）、IgM抗体捕捉ELISA法、免疫层析法等,标本检测与解释,IgM抗体捕捉ELISA法和免疫层析法主要用于血清中IgM的检测 IFA、双抗原夹心ELISA法、间接ELISA和单扩溶血试验（SRH）用于检测血清中全抗体/IgG/中和抗体（四倍及四倍以上增高）,标本检测与解释,NT在一些病毒难于分离的病毒性疾病实验室检测中，成为实验室确诊的“金标准”,标本检测与解释,病毒性疾病的实验室检测绝非通过一种检测方法就能够解决，一般都是通过两种或两种以上检测共同完成的 质控 SOP 先进方法与传统方法 传统方法的改良,平阴县人民医院 (Pingyin Peoples Hospital),平阴县中医院 (Pingyin Traditional Chinese Medicine Hospital ),文登市妇幼保健院 (Wendeng Maternity and Child Care Service Center),文登市中心医院 (Wendeng Central Hospital),文登开发区医院 (Wendeng Development zone Hospital),唾液样品质量控制 Saliva Sample Quality Control,对855份唾液样品进行RNaseP PCR检测，占已检测样品总数的25.08%（855/3409），其中阴性5份，占0.58%（5/855)，有效样本达到99.42%（850/855),DBS样品质量控制 DBS Sample Quality Control,对724份DBS样品进行RNaseP PCR检测，占已检测样品总数的22.04%（724/3285），其中阴性1份，占0.14%（1/724)，有效样本达到99.86%（723/724),平阴县人民医院 (Pingyin Peoples Hospital),平阴县中医院 (Pingyin Traditional Chinese Medicine Hospital ),文登市妇幼保健院 (Wendeng Maternity and Child Care Service Center),文登市中心医院 (Wendeng Central Hospital),文登开发区医院 (Wendeng Development zone Hospital),标本检测与解释,病毒性疾病的实验室检测绝非通过一种检测方法就能够解决，一般都是通过两种或两种以上检测共同完成的 质控 SOP 先进方法与传统方法 传统方法的改良,Thank you for your attention,