2007-9-10,Bitab,1,细菌内毒素检查技术 讲 义,北京毕特博生物技术有限责任公司 2007年9月,2007-9-10,Bitab,2,目 录,一、细菌内毒素检查的基础理论-3 二、 BET试验前的准备-24 三、细菌内毒素检查的实验技术-28 1，鲎试剂灵敏度复核-33 2，干扰初筛试验-40 3，干扰试验-49 4，检查法-62 四、细菌内毒素检测技术的发展,2007-9-10,Bitab,3,一、细菌内毒素检查的基础理论,1，细菌内毒素 2，鲎试剂 3，BET用水 4，BET程序 5，2005年版细菌内毒素检查法 6，相关参数的计算 7，试验的相关知识,2007-9-10,Bitab,4,1、细菌内毒素 1）化学成分及特性 - 革兰氏阴性细菌细胞壁的产物 - 是高分子量脂多糖复合物（LPS） 除上述性质外，LPS还有许多其他的生物活性,（1）特性,2007-9-10,Bitab,5,内毒素的分子结构,（2）化学结构 - 含有3个截然不同的区域,O- 特异侧链 核心多糖 类脂A,2007-9-10,Bitab,6,2） 内毒素与热原的关系 - 内毒素是热原之一种 - 医药工业接受的观点是，内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原，控制内毒素污染就等于控制热原污染。 3）标准内毒素和环境内毒素 1）标准内毒素 经人工提取精制并经生物效价测定的细菌内毒素，作为BET检查的参考品或对照品。主要分参考标准品（RSE）及工作标准品（CSE）。CSE的效价必须用RSE来标化。目前CSE的效价有两种标示方法：固定效价法（中国）及浮动效价法（国际）。 2）环境内毒素 天然产生的内毒素，普遍存在于水、空气及各种原料中，成分除了脂多糖外还含有较多的蛋白质、多糖和其他杂质，其极性不明显，致热性较标准内毒素弱。BET的对象是环境内毒素。,2007-9-10,Bitab,7,4）标准内毒素溶液（C溶液）的制备 1）中国药典2005年版的BET法规定，将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解后，需在旋涡混合器上混匀15分钟，以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟，其他国家药典都有类似要求 - 具有极性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布,2007-9-10,Bitab,8,2、鲎试剂,1）鲎试剂的分类 - 根据鲎的种类分类 美洲鲎试剂(LAL) 中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL） - 根据检查方法分类 凝胶法鲎试剂 光度法鲎试剂 - 根据鲎试剂的反应特异性分类 普通鲎试剂 特异型鲎试剂,2007-9-10,Bitab,9,2）鲎试剂的规格 - 一般分单次试验试剂和多次试验试剂（也称大装量试剂） - 把自身的包装容器作为反应管的试剂称为单次试验试剂，在国内使用的0.1ml/支的鲎试剂就属于单次试验试剂 - 多次试验试剂有0.5ml/支、1.2ml/支等，使用时应先用相应量的溶解液复溶鲎试剂。,2007-9-10,Bitab,10,3）鲎试剂的质量标准 - 灵敏度 定义：再细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试剂产生凝集的标准内毒素的最低浓度，单位EU/ml。 常用鲎试剂的灵敏度：0.5EU/ml、 0.25EU/ml、 0.125EU/ml、 0.06EU/ml、0.03EU/ml - 自身凝集 部颁标准，鲎试剂的阴性对照在37度4小时不产生凝集反应 - 缓冲能力 - 干燥失重 - 无菌：中国标准无此项要求,2007-9-10,Bitab,11,4）鲎试剂与内毒素的反应机理,C因子,活化的C因子,内毒素,活化的B因子,B因子,凝固酶,凝固酶原,凝固蛋白（凝胶）,凝固蛋白原,葡聚糖或LAL-RM,活化的G因子,G因子,二价阳离子,AC-lle-Glu-Ala-Arg-pNA,（酶作用物）,AC-lle-Glu-Ala-Arg-OH,pNA,405nm测吸光度值,（对硝基苯胺 黄色）,2007-9-10,Bitab,12,3、BET用水,2000年版药典要求，BET用水应为与0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在371条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。 2005年版药典要求，凝胶法BET用水应为内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；光度测定法用的BET用水内毒素含量应少于0.005EU/ml。 美国药典要求的BET用水是指与所使用的鲎试剂不发生反应的灭菌注射用水或其他水。,2007-9-10,Bitab,13,4、BET程序,1）验证实验 凝胶法 光度测定法 2）检查法 凝胶法 光度测定法 动态法 终点法：终点比色法试验,灵敏度的复核试验,干扰试验,标准曲线可靠性试验,干扰试验,凝胶限量试验,凝胶半定量试验,动态比浊法试验,动态比色法试验,动态终点法,2007-9-10,Bitab,14,5、中国药典2005年版细菌内毒素检查法,1）综述部分 细菌内毒素检查法的定义及BET方法学分类 内毒素标准品及检查用水 BET器具的要求 供试品溶液的要求 内毒素限值的确定 最大有效稀释倍数的计算,2007-9-10,Bitab,15,2）试验部分,（1）凝胶法 鲎试剂灵敏度复核试验 干扰试验 检查法 （2）光度测定法 标准曲线的可靠性试验 干扰试验 检查法,3）2005年版药典BET法际验部分主要内容,凝胶限量试验,凝胶半定量试验,2007-9-10,Bitab,16,2007-9-10,Bitab,17,1）内毒素限值 （1）药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg(活性单位)表示； K为人每公斤体重每小时科接受的最大内毒素剂量，以EU/(kgh)表示，注射剂K=5 EU/(kgh),放射性药品注射剂K=2 EU/(kgh),鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kgh), M为人每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kgh)、mg/(kgh)、 U/(kgh)表示，人均体重按60Kg计算，注射试剂若不足1小时，按1小时计算。,6、相关参数的计算,2007-9-10,Bitab,18,（2）内毒素限值计算举例 - 注射用的头孢曲松钠舒巴坦钠，成人最大剂量为1500mg/次 L= =0.20EU/mg - 注射用人头孢孟多酯钠，成人每日剂量为2.0至8.0g，分3至4次给药，一日最高剂量不超过12g L= =0.075EU/mg - 对于大输液（LVP）,美国药典（USP）通常都取L值为0.5EU/ml,5 EU/(kgh),1500 mg/(60kgh),5 EU/(kgh),(12000mg/3) / (60kgh),2007-9-10,Bitab,19,2）最大有效稀释倍数 - 供试品最大有效稀释倍数（MVD）按以下公式计算 MVD=CL/ C为供试品溶液的浓度，其中当L以EU/ml表示时，C为1.0ml/ml;当L以EU/mg或EU/U表示时,C的单位为mg/ml或 U/ml。凝胶发中，为鲎试剂的灵敏度 光度测定法中，为标准曲线最低浓度 - 如使用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠舒巴钠（浓度为10mg/ml,L=0.2EU/mg）的最大有效稀释倍数为 MVD= =8 (倍),10mg/ml x 0.2EU/mg,0.25EU/ml,2007-9-10,Bitab,20,0.20EU/mg,0.25EU/ml,2007-9-10,Bitab,21,7、试验相关知识,1) 内毒素标准品的使用 （1）复溶 - 复溶2ml安瓿装的内毒素标准品，为了避免溶液再混合时溢出安瓿，我们建议在安瓿颈部上方开口加液。 复溶液的体积一般为1ml,或根据使用说明书加液。 （2）效价 - 厂家必须向用户提供一份效价分析证书（Certificate of Analysis,CoA） 效价分析证书应注明：RSE/CSE _EU/mg; _ng/瓶,2007-9-10,Bitab,22,2) 鲎试剂的使用 - 使用前，应将鲎试剂置于室温环境下使其大道室温温度鲎再复溶使用 - 复溶鲎试剂鲎，应避免强烈振动产生泡沫 - 由于鲎试剂与内毒素凝集反应的不可逆性，反应过程中必须避免反应试管的振动造成假阳性 3）内毒素的清除 （1） 冲洗 适用于器械组件、塞子等 可用于加热等方法提高清除效率 （2）蒸馏，折流系统和地心引力阻止大分子量的LPS转变为蒸汽状态逸出 （3）反渗透 （4） 超滤 （5）活性炭吸附,2007-9-10,Bitab,23,4）内毒素的灭活 （1） 酸/碱水解 （2）氧化 - H2O2 （3）干热 - 250，30分钟的干烤,2007-9-10,Bitab,24,二、BET试验前的准备,1. 在细菌内毒素检查试验中，凡是与试验样品或试剂接触的器具必须经过除热原处理。 玻璃器皿一般用洗液浸泡4小时后，用自来水冲洗，再用真馏水冲洗、晾干。最后在280干烤至少120分钟。,2007-9-10,Bitab,25,2. 试验所试用的器具主要包括有： 无热原稀释管 无热原玻璃移液管 无热原玻璃毛细管 稀释试管架 安瓿试管架 反应试管架 可调移液器 连接胶粒 无热原吸头 安瓿开启器 70%的异丙醇浸泡的无纺布拭布,2007-9-10,Bitab,26,3. 实验中也可用一次性的无热原塑料器械。 如用可调移液器和无热原吸头代替无热院玻璃移液管取液等。 在使用可调移液器连接无热原毛细管吸取微量溶液时，采用多吸少打方式。避免由于毛细管的虹吸作用带来的加样误差；也可避免微量加样时产生气泡。,2007-9-10,Bitab,27,4. 细菌内毒素检查实验的恒温反应在37的恒温器中进行。 TAL-40型试管恒温仪（安度斯设计生产），专门用于细菌内毒素检查的恒温仪器。具有 A, 温度稳定； B, 加热均匀； C, 定时报警等特点,2007-9-10,Bitab,28,三、凝胶法细菌内毒素检查技术,1，凝胶法BET试验程序 2，试验器具 3，鲎试剂灵敏度复核 4，干扰初筛试验 5，干扰试验 6，检查法,2007-9-10,Bitab,29,1、凝胶法BET的实验程序 1）试验准备：试剂、仪器及实验用具等 2）确定供试品的内毒素限值（L） 3）选择鲎试剂（） 4）计算供试品的最大有效稀释（MVD）或最低有效浓度（MVC） 5）鲎试剂灵敏度复核 6）供试品干扰初筛试验（建议试验） 7）供试品干扰验证试验 8）供试品日常检查,2007-9-10,Bitab,30,2、试验器具,1）器具的要求及处理 -玻璃器皿需除热原处理，以除去可能存在的外源性内毒素，常用方法是玻璃器皿经清洗后250至少干烤1小时 -塑料器械应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械 -首选硼硅酸盐玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具 2）孵育反应仪器 温度精确：370.2 发热均匀：0.1 可定时提示：0至90分钟可设定定时蜂鸣提示 试管免封口,2007-9-10,Bitab,31,3 、鲎试剂灵敏度复核试验,1）鲎试剂灵敏度复核实验目的 1）验证实验室的条件是否满足BET实验的要求 2）验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的要求 3）验证实验所用试剂（包括鲎试剂