流式细胞仪在临床检测和临床科研中的应用,李 柏 青 蚌埠医学院免疫学教研室,-2-,流式细胞仪和流式细胞术概述 流式细胞仪的工作原理和测量参数 流式细胞仪在临床检测和科研中的应用 免疫学检测和科研应用 血液病检测和科研应用 肿瘤学检测和科研应用,流式细胞仪的基本工作原理以及在基础和临床科研中的应用,-3-,一、流式细胞仪和流式细胞术的基本概念,流式细胞仪(Flow Cytometer， FCM): 是集合光电子物理，光电测量技术， 液流技术，计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器。,-4-,一、流式细胞仪和流式细胞术的基本概念,流式细胞术(Flow Cytometry，FCM): 是应用流式细胞仪，对处于快速流动液体中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速测量和定量分析，以及分选的技术。,-5-,一、流式细胞仪和流式细胞术特点,多参数测量和分析（散射光和荧光） ； 快速测量和分析 每秒可达1000-10000个细胞 分选纯度可达99%以上。 获取的数据分析结果更具有统计学意义； 通常测量的对象如各种细胞细胞必须处在单个细胞悬液中。此外，也可测量微生物等生物颗粒，或者工合成微球非生物颗粒，,-6-,台式机FACSCalibur,双激光 488nm 635nm 四荧光参数 分选、浓缩系统,7,-8-,大型机FACSVantage SE,科研型 八荧光参数 高速分选 多路分选,-9-,流式细胞仪与荧光显微镜比较,流式细胞仪 荧光显微镜,流动的细胞 静止的细胞样本 数量大 数量少 高速分选 样本难以再利用 细胞群体特征量分布 可揭示细胞内部结构信息,-10-,二、流式细胞仪的工作原理和测量参数,光路系统： 激光光源，光路系统（透镜、滤光片） 电子系统：光电倍增管（PMT），补偿电路 液流系统： 鞘液系统，样品流动系统 数据系统：计算机，数据测量和分析软件。 细胞分选系统,（一） 流式细胞仪的结构,-11-,流式细胞仪光路系统,激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照 激光波长: 488nm, 635nm 光收集系统是由若干组透镜, 滤波片, 小孔组成，将产生的光信号引导至检测器,-12-,光路系统,-13-,Injector Tip,-14-,Injector Tip,Fluorescence,signals,Focused laser,beam,Sheath fluid,-15-,流式细胞仪光学系统,激发光源与荧光标记物,-16-,光学检测信号,-17-,流式细胞仪的光学系统 FACSCalibur,-18-,流式细胞仪液流系统,-19-,液流系统：鞘液系统样品流动系统,-20-,流式细胞仪的电子系统,信号检测和分析 当细胞携带荧光素, 通过激光照射区, 受到激发产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收，转变为电脉冲信号， 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、作图和统计分析,-21-,数据系统,-22-,（二） 流式细胞仪可检测的细胞参数,细胞结构 细胞大小 细胞颗粒性程度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量,细胞功能 细胞表面蛋白抗原 细胞胞浆内蛋白性抗原 细胞内细胞因子 细胞增殖 细胞内钙离子浓度,二、流式细胞仪的工作原理和测量参数,-23-,（二） 流式细胞仪可检测的细胞的参数： 散射光信号,前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 入射光的前向 (5)散射光信号, 可反映：细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC, Side Scatter） 入射光90角的散射光信号， 可反映：细胞颗粒性程度 （胞内成分和构造和表面结构的复杂性）,-24-,散射光信号,前向角散射光FSC,-25-,散射光信号,侧向角散射光SSC,-26-,流式细胞的基本信息: “形态”,-27-,-28-,外周全血细胞（红细胞溶解后） 以散射光表示的 双参数 点图,-29-,外周全血细胞（红细胞溶解后） 以散射光表示的 双参数 点图,中性粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,-30-,（二） 流式细胞检测细胞参数: 特征信息荧光（Fluorescence）信号,荧光素吸收激光（激发光波长）能量 荧光素将吸收能量释放，转换为 释放较入射光波长更长的光量子（发射光波长） 荧光素与特异抗体结合（荧光抗体） 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生荧光信号越强 荧光素与细胞核酸结合，荧光强度反映核酸含量,-31-,（二） 流式细胞检测细胞参数: 特征信息荧光（Fluorescence）信号,Forward scatter (FSC) Side scatter (SSC) FL1 （第一荧光） -FITC(异硫氰酸荧光素） FL2 （第二荧光） -PE（藻红蛋白） FL3 （第三荧光） -PerCP, PeCy5等 PL4 （第四荧光） -APC（藻青蛋白）,-32-,荧光信号,-33-,-34-,荧光信号,双色直接染色,-35-,（三） 流式细胞仪分析数据常见图形： （二维）点陈图 (Dot Plot),适用于：双参数分析,-36-,（三） 流式细胞仪分析数据常见图形： 直方图(Histogram Plot),适用于： 单参数分析 仅需要观察某个荧光强度的变化,-37-,流式细胞术检测细胞的荧光 标记方法,单标： 一种单抗 : FL1, FSC, SSC（三参数） 双标： 两种单抗：FL1, FL1, FSC, SSC（四参数） 三标： 三种单抗：FL1,FL2, FL3,FSC, SSC（五参数） 四标四种荧光标记抗体： 四种单抗：FL1,FL2,FL3,FL4,FSC,SSC（六参数）,-38-,淋巴细胞亚群分析,细 胞 凋 亡,肿瘤学,移植免疫,三 流式细胞仪在临床检测和科研中的应用,血小板,其 它,www.gotofcm.com,-39-,淋巴细胞亚群分析,www.gotofcm.com,-40-,-41-,-42-,-43-,T淋巴细胞,淋巴细胞亚群检测： T cells, T subsets, NK cells, B cells,-44-,淋巴细胞亚群,www.gotofcm.com,-45-,淋巴细胞亚群,www.gotofcm.com,-46-,淋巴细胞亚群与疾病,www.gotofcm.com,-47-,淋巴细胞亚群检测意义,疾病机理研究,疾病辅助诊断,移植后免疫检测,治疗方案的确定及疗效评价,CD25高于正常值5-10%, 表明即将或已发生排斥 CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染 0.2时, 必须停用免疫抑制剂 CD2+HLA-DR+增加5-10%, 且不伴有CD25的增加, 提 示巨细胞病毒感染,慢性疲劳, 感染后综合征, 纤维肌痛, 类风湿性关节炎, 过敏等,疾病预防,www.gotofcm.com,-48-,淋巴细胞亚群检测意义,鉴别活动期和非活动期SLE,www.gotofcm.com,-49-,HIV AND AIDS,-50-,Th1/Th2细胞,www.gotofcm.com,-51-,Th1/Th2细胞,Th1型细胞因子介导 细胞免疫反应 引起迟发型过敏反应、巨噬细胞活化、局部炎症 刺激来源：病毒、某些细菌 Th2型介导体液免疫反应 引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、 促进I型变态反应（过敏反应） 刺激来源：多细胞寄生虫、过敏原,-52-,Th1/Th2细胞,PMA+Ionomycin 刺激4-6hr,www.gotofcm.com,-53-,流式细胞仪检测胞内细胞因子,新鲜分离PBMC 加PMAIo刺激后6h 测定胞内细胞因子IL-4和IFN-g,检测免疫细胞表型和结合检测胞内细胞因子： 操作和分析方法；,-54-,四色标记胞内因子FCM检测,-55-,Th1/Th2失衡相关疾病,嗜酸性细胞增多和IgE升高相关疾病 Ommens Syndrome(Ommens综合征) Hyperosinophilic Syndrome(高嗜曙红细胞综合征) Kimuras Disease(Kimuras疾病) Wells Syndrome(Wells 综合征) 传染病 病毒性疾病 人类免疫缺陷性病毒感染和爱滋病(AIDS) 麻疹 呼吸道合胞体病毒感染 慢性活动性乙型肝炎病毒感染 分枝杆菌和其它细菌感染 麻疯病/肺结核 鸟结核分枝杆菌复合感染 滑膜炎反应性关节炎 淋病和梅毒,www.gotofcm.com,-56-,Th1/Th2失衡相关疾病,寄生虫病 原寄生虫感染：皮肤和内脏利什曼病 蠕虫病：丝虫病和血吸虫病 真菌性疾病 过敏性支气管肺霉菌病 念珠菌病 隐球菌病 类球孢子菌病 球孢子菌病 组织胞浆菌病 恶性肿瘤 皮肤基底细胞和鳞细胞癌 Sezary Syndrome (Sezary综合征) 淋巴瘤 EBV相关的B细胞和非何杰金氏淋巴瘤 何杰金氏淋巴瘤 大细胞退行性(CD30+)淋巴瘤 多发性骨髓瘤和Castlemans综合征 卡氏肉瘤,www.gotofcm.com,-57-,Th1/Th2失衡相关疾病,变应性疾病 皮肤性哮喘 变应性哮喘 春季结膜炎 炎性和自身免疫性疾病 巨细胞(暂时性的)动脉炎 系统性红斑狼疮 类风湿性关节炎 自身免疫性甲状腺疾病 类肉瘤病 银屑病(牛皮癣) IgA肾病 多发性硬化,www.gotofcm.com,-58-,Th1/Th2细胞检测意义,疾病治疗,发病机制研究,使用Th1和Th2相关的细胞因子 IFN-治疗麻疯病,用抗Th1和Th2相关细胞因子或其受体的抗体 抗IL-4抗体治疗真菌和寄生虫感染,使用调节Th2/Th2细胞因子平衡的药物: 萨力多胺(Thaliodomide) 治疗巨细胞动脉炎,疾病治疗监测,www.gotofcm.com,-59-,www.gotofcm.com,-60-,肿瘤发生发展,www.gotofcm.com,-61-,0,200,400,600,800,1000,PI 荧光强度(DNA含量),DNA含量分析,2N,4N,Counts,G0/G1,G2/M,S,www.gotofcm.com,-62-,DNA含量分析,70%人类癌症中存在着异倍体或细胞周期的改变,1. Ross JS. DNA Ploidy and Cell Cycle Analysis in Pathology. New York: Igaku-Shoin;1996:47-60,DNA倍体和S期比例-指导治疗2 卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，原发部位不明的癌症 -早期 (I/II期) DNA倍体和DNA指数-预后长期和无病生存期2 卵巢癌-晚期,2. The Recommend Medicare National Coverage Policy for Flow Cytometry. HCFA Website,1999,www.gotofcm.com,-63-,P53/Bcl-2,www.gotofcm.com,-64-,P53,乳腺癌,与病理学分级有关, 并与乳腺癌的淋巴结转移显著相关,大肠肿瘤,早期发现大肠癌,胃 癌,与预后相关,肝细胞癌,与组织分级, 肿瘤预后, 转移及肿瘤大小密切相关,www.gotofcm.com,-65-,Bcl-2,Bcl-2在正常组织中的表达,造血系统细胞 淋巴, 单核细胞等 受激素或生长因子调节的腺上皮 前列腺上皮, 子宫内膜等 干细胞或增值细胞 皮肤的基底细胞, 肠上皮 寿命长的分裂细胞 神经元 胚胎组织,Bcl-2在