血清清蛋白、-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定 一、实验目的 1.掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 2. 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 3.掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4.掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 5.学习柱层析技术 二、实验原理 蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。 （一）粗提原理-盐析法 1.盐析法：在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度， 或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。 2.水化膜减弱、消失。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。 3.蛋白质表面的电荷大量被中和。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。 4.由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。 （二）脱盐原理-凝胶层析 1.盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。 2.凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术。 （三）纯化原理-离子交换层析 离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 （四）纯度鉴定-醋酸纤维素薄膜电泳 血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白5条区带。 三、材料与方法： （一）实验材料 1.样品：人混合血清 2.试剂：葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)层析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱、各不同浓度的pH6.5醋酸铵缓冲溶液、pH8.6巴比妥缓冲溶液、氨基黑10B染色液、20%磺基水杨酸溶液、饱和硫酸铵溶液、1%BaCl2溶液、漂洗液 器材：层析柱、电泳仪、电泳槽、离心机、离心管、黑色反应板等 （二）实验方法 取血清1.0ml，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min 1.实验步骤 盐 析 沉淀（含球蛋白） 加水 0.6ml溶解 上清液（含清蛋白、少量 球蛋白和球蛋白） 过葡聚糖凝胶G-25 层析柱（1.07cm） 过葡聚糖凝胶G-25 层析柱（1.07cm） 用1ml 0.02mol/L NH4 AC缓冲液清洗层析柱 内壁,流出液量约1ml 用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,流出液量约1ml 凝胶柱层析除盐 继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液(2ml)洗脱 继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液(2ml)洗脱 磺基水杨酸 检测蛋白质 磺基水杨酸 检测蛋白质 收集含有蛋白质的峰液15d 收集含有蛋白质的峰液15d 继续用2ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液洗涤 继续用0.02mol/L NH4AC缓冲液洗涤约2ml BaCl2检测 至SO42-阴性 BaCl2检测 至SO42-阴性 用23ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡 用23ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡 离子交换柱层析纯化 除盐后收集的球蛋白 除盐后收集的清蛋白 过DEAE-纤维素层析柱 （1.06cm） 过DEAE-纤维素层析柱（1.06cm） 用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液(3ml)洗脱，流出液量约1ml开始检测蛋白质 离子交换柱层析纯化 用1ml 0.06mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,用约5mL 0.06mol/L NH4AC缓冲液流洗，除去球蛋白和球蛋白 磺基水杨酸 检测蛋白质 收集含有蛋白质的洗脱液每管10d，连续收集3管 用0.3mol/L NH4AC缓冲液(约3ml)洗脱，流出液量约2ml开始检测蛋白质 磺基水杨酸 检测蛋白质 DEAE-纤维素柱不用再生，可直接用于纯化清蛋白 收集含有清蛋白的洗脱液每管10d，连续收集2管 取浓度最高的1管作纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法） 离子交换柱再生和蛋白纯度鉴定 DEAE-纤维素柱先用6ml l.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4AC溶液流洗，再用10ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液流洗再生平衡 2管均作纯度鉴定 (醋酸纤维素薄膜电泳法) 用镊子取出薄膜，吸去多余的缓冲液，粗面朝上置于载玻片上，在薄膜一段1.5-2.0cm处用铅笔标记点样线 准备 醋酸纤维素薄膜电泳 点样 用玻片沾取样品，垂直落下于点样线并迅速提起 将已点好样品的薄膜架在电泳槽上，点样面朝下，点样端置阴极，轻轻拉平薄膜，盖上电泳槽盖，打开电源，开始电泳，时间约为50min 电泳 电泳完毕后用镊子取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min 染色 漂洗 从染色液中取出已染好的薄膜条投入漂洗液中，反复漂洗3-4次，直至背景无色为止 将漂洗干净的薄膜完全干燥后，观察实验结果并拍照记录 干燥 2.注意事项 上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此。 洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并注意层析柱不要流干，进入空气。 切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SO42-的BaCl2混淆，因二者与相应物质生成的沉淀均为白色。 四、结果与讨论： （一）实验现象 1.盐析 1）加入饱和硫酸铵溶液后，血清变成乳黄白色浑浊溶液。如图3-1 2）离心后出现明显的分层现象，上清液呈黄色透明，沉淀呈乳黄白色。如图3-2 图3-1 图3-2 2.凝胶柱层析除盐 1）将沉淀溶液加入过葡聚糖凝胶G-25层析柱后，层析柱内无色透明溶液变浑 浊，之后，随着溶液的流出（流速缓慢），层析柱上层液体逐渐变清澈呈黄色。 2）经过缓冲液的洗脱后，将过葡聚糖凝胶G-25层析柱内溶液滴入加有磺基水杨酸的黑色反应板空中，检测蛋白质，出现白色沉淀。见右图3-3红框 图3-3（红框内为磺基水杨酸，蓝圈内为BaCl2） 3）接着，收集含有蛋白质的峰液（球蛋白）呈 无色透明。 4）用BaCl2检测SO42-没有沉淀（即为阴性），进行再生平衡。见上图3-3蓝圈 5）将上清液加入过葡聚糖凝胶G-25层析柱中，层析柱内无色透明溶液变成淡黄色透明溶液。 6）用磺基水杨酸检测蛋白质，同样出现白色沉淀。见图3-4 7）接着，收集含有蛋白质的峰液（清蛋白）呈淡淡的黄色透明状。 图3-4 8）用BaCl2检测没有沉淀（即为阴性），进行再生平衡。 3离子交换柱层析纯化 1）收集含有蛋白质的洗脱液3管（球蛋白）呈无色透明。 2）用磺基水杨酸检测蛋白质，未出现明显白色沉淀。 3）连续收集2管含有清蛋白的洗脱液，均为很淡很淡的黄色透明溶液，几乎接近无色。 4醋酸纤维素薄膜电泳 1）电泳结束后，醋酸纤维素薄膜没有出现现象。 2）将薄膜从染色液中取出，薄膜染上深蓝色。 3）将薄膜漂洗干洗后，深蓝色消失。 4）取出薄膜后，具体情况如下图 -球蛋白 -球蛋白 -球蛋白 清蛋白 由上图可见，本次实验成功显现出了清，球蛋白的条带，然而颜色过浅，色带过于模糊，与下图另一小组所做的结果形成了鲜明的对比。 分析讨论 在脱盐步骤中，收集球蛋白、清蛋白时机太晚，虽然是在磺基水杨酸检测出蛋白质后才收集的，很可能前面已经流走大量蛋白质了 在纯化步骤中，纯化球蛋白时，因为粗心，未等层析柱上的球蛋白溶液下降到凝胶床便加0.02mol/L的NH4Ac，对球蛋白溶液造成了稀释，加之收集的时候太过心切，且磺基水杨酸检测一直无反应，很可能错过了球蛋白流出的峰期，没收集到足够的球蛋白。 回顾反思 纯化球蛋白的时候，是利用清蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白等电点的不同，令前三者吸附在离子交换柱上，用0.02mol/L的NH4Ac洗出球蛋白，再往离子交换柱加入除盐后的清蛋白，利用清蛋白所带电荷多，球蛋白、球蛋白所带电荷少，所以加入0.06mol/L的NH4Ac是为了洗脱球蛋白、球蛋白，最后加入3mL0.3mol/L的NH4Ac是为了把最后留在离子交换柱上的清蛋白洗脱出来。因而每个步骤的时间掌控，液体收集的滴数，所加试剂的量都会非常敏感地影响实验结果，因而我们仍需加强实验基础操作训练，做好预习工作，事先分工并模拟实验进行。 附：思考题 1.硫酸铵盐析一步,为什么是1ml血清加0.8ml饱和硫酸铵? 调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。1.0ml血清加0.8ml饱和硫酸铵的目的是将饱和硫酸铵稀释为半饱和硫酸铵，在此浓度下清蛋白不沉淀，成为上清液，球蛋白沉淀，这样就可以将两者分离。综上所述，1.0ml血清加0.8ml饱和硫酸铵，盐析效果会比较好。 2.为什么实验中DEAE纤维素柱分离-球蛋白后不用再生,可直接用于纯化清蛋白？ 因为DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，带正电荷，而-球蛋白带正电荷，能够不被吸附而从层析柱流出，而且带负电荷的清蛋白能够与DEAE纤维素进行阴离子交换而结合，只要提高醋酸铵缓冲液的浓度就能够洗脱出清蛋白。 3.应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和-球蛋白的纯度,根据什么来确定它是清蛋白还是-球蛋白?判定它们纯度的依据是什么? 根据醋酸纤维素薄膜上的区带对照血清蛋白区带的位置，可以判断是清蛋白还是-球蛋白。-球蛋白在缓冲液中带负电荷少，在电场中比其它蛋白质移动速度慢，而清蛋白在电场中移动速度最快，所以最接近点样线的是-球蛋白，最远离点样线的是清蛋白。判定纯度的依据是区带的条数，因为不同蛋白质的等电点不同，电泳后的区带也不同。