靶向PCR CTC检测技术 帮助临床医生更全面地评估肺癌,Lung Cancer in Solid Tumor in China,=,？,液态活检 通过外周血中的肿瘤细胞或者肿瘤基因组信息来评估肿瘤,病理活检 通过原发灶肿瘤组织来评估肿瘤,CTC ctDNA mircoRNA LNC RNA Others,传统的组织细胞学检测,液态活检在肺癌中的应用,治疗策略,事件,疑似肺癌,辅助诊断,早癌肺癌,晚期肺癌,癌症耐药,复发监测,治疗方案选择,耐药机理 新药研发,CTC的临床应用价值,疗效评估,CTC(数量） (负向富集+靶向PCR）,ctDNA (基因变异）,1、K. Pantel, et al. Nat Rev Clin Oncol, 2009;2、K. Pantel and MR. Speicher, Oncogene 2015,什么是循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）？,肿瘤释放如外周血中CTCs数量的多少，可间接反应肿瘤发生发展的功能状态,CTC：在肿瘤发生过程中，具有干细胞特征的肿瘤细胞和不具有干细胞特征的肿瘤细胞，均由原发肿瘤脱落释放入外周血，两者统称循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell）CTC1,CTC有转移：侵入第二器官CTCs，称之为DTC（disseminated Tumor Cell），只有由具有干细胞特征的DTC所形成的微转移灶，逃避免疫识别才可能发展成为肿瘤远处转移2,什么时候可以检测到CTC？,早期肿瘤外周血中即可检出CTC,W He, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007,早期肿瘤外周血中即可检出CTC,表达中等量FR的M109鼠肺癌细胞通过皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部侧面 移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分钟可以检测到大约1.4个CTC细胞 移植后第3和第4周，则每分钟可分别检测7个和18个CTC，随着肿瘤逐渐增大数量呈指数上升 在肿瘤移植的前4周内，没有在任何组织切片中发现到存在转移性癌症的迹象,CTC富集技术 密度与大小 免疫磁珠（负向富集 or 阳性富集) 微流体,CTC 检测方法,CTC检测技术 靶向PCR 免疫荧光 普通PCR,=,+,“方法”,“收获”,“垃圾”,蟹饵,没水了， 我们躲不了了,放 水,负向富集,优势：回收率100% 劣势：纯度略低,幸好没贪嘴， 我们逃了,“方法”,“收获”,“垃圾”,没水了， 我们躲不了了,放 水,负向富集,优势：回收率100% 劣势：纯度略低,幸好没吃胖， 我们逃了,网 筛,CytoploRare （FR靶向PCR CTC检测技术） 检测原理,负向富集,靶向PCR,FR阳性靶标,肺癌细胞FR(叶酸受体）高度表达 CTC：FR=1:50万 EMT转化不影响FR丰度 其他血细胞不表达FR,CTC回收率接近100% 磁珠富集易操作和自动化,灵敏度超高，负向富集可满足检测要求 信号二次放大，1个CTC信号放大1012倍 无需人工经验判读，结果客观准确 可实现CTC的定量,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测 靶向PCR，信号放大，保证高度敏感性,1个CTC信号放大1012倍,优势一：阴性富集不丢失循环肿瘤细胞,优势二：靶向探针特异性高,优势三：PCR扩增信号，确保高敏感性,优势四：PCR仪判断CTC技术，避免人为误差,CytoploRare,敏感性 特异性 可重复性 临床应用便捷性,CytoploRare,敏感性 特异性 可重复性 临床应用便捷性,3mL血,1mL/3mL血,3mL血,1个CTC/3mL血,50万FR/1个CTC,1个CTC/1slide,100万信号/1个FR,1个信号/1个CTC,FR靶向PCR 1个CTC细胞信号方法1012倍（万亿倍）,细胞免疫荧光 1个CTC细胞信号几乎没有放大,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测 敏感性试验：1ctc in 1,200,000白细胞,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,将不同数量的FR阳性肿瘤细胞分别掺入3ml全血(1.2-3.0X107） FR靶向PCR CTC检测技术的回收率接近100%，且呈线性分布 检测灵敏度约为5.09/（1.23*107）=1/240万600万,将不同数量的FR阳性肿瘤细胞分别掺入3ml全血(1.2-3.0X107） 检测灵敏度约为5.09/（1.23*107）=1/240万600万,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测 敏感性试验：1ctc in 6,000,000白细胞,CytoploRare,敏感性 特异性 可重复性 临床应用便捷性,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术 FR（叶酸受体，高度特异性的靶向探针）,特异性高：加入FR靶向探针前，加入高浓度叶酸封闭细胞表面的叶酸受体，检测结果为阴性,背景表达：去除FR靶向探针，仅保留特异性DNA片段，与保留FR靶向探针相比，检测结果一致，提示背景可能为特异性DNA片段所致的固定值,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,Cell Search:正向富集+免疫荧光技术进行捕获和鉴定,22,EpCAM 上皮细胞粘附分子 APC 异藻蓝蛋白荧光染料 CK 细胞角蛋白 PE 藻红蛋白荧光染料 DAPI 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA荧光染料）,EpCAM阴性细胞中，存在大量CTC,Cell Research系统主要使用EpCAM（上皮粘附分子）做为探针 研究证实，EpCAM阴性的细胞中也存在CTC,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,2004,Cell Search: 乳腺癌中检测出，但肺癌敏感性低,2011,Cell Research: 采用的抗体(EpCAM)对EMT细胞特异性差，而肺癌细胞转移入血需要EMT的过程,有报道，部分激活的巨噬细胞存在FR的高表达1 临床前研究证实，这部分巨噬细胞很少在正常人的外周血中出现2 使用抗CD14免疫磁珠去除巨噬细胞后，CTC的检测结果无明显改变3,1、He W, et al. Int J Cancer 2008; 2、He W, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007; 3、Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术 巨噬细胞（可能存在FR表达）不影响检测结果,CytoploRare,敏感性 特异性 可重复性 临床应用便捷性,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术 同一患者重复检测，可重复性高,CytoploRare,敏感性 特异性 可重复性 临床应用便捷性,3mL血6个小时得到报告,检测流程,肺癌领域，CTC检测技术对比,唯一获得CFDA批准的肺癌CTC检测试剂盒,CTCs：可反应肿瘤发生发展的功能状态,Cancer Control, 2015,肺癌辅助诊断 降低胸部CT假阳性率，减少肺癌漏诊 肺癌化疗疗效评估 评估肿瘤功能活性状态，弥补RECIST标准不足,CTCs：可反应肿瘤发生发展的功能状态,Cancer Control, 2015,肺癌辅助诊断 降低胸部CT假阳性率，减少肺癌漏诊 肺癌化疗疗效评估 评估肿瘤功能活性状态，弥补RECIST标准不足,1210例受试者,肺癌 560例,肺部良性疾病 350例,其他肿瘤 (150例) 肝癌 30例 结直肠癌 30例 乳腺癌 30例 胃癌 30例 食管癌 30例,331例A 100例B 50例C（21例D) 79例D,A: 基线CTC检测 B：术前术后CTC监测 C：一线含铂双药化疗中CTC监测 D：基线CTC、CEA、CYFRA21-1、SCC、NSE检测,300例A 50例D,健康人 150例,100例A 50例D,150例A,非动态研究 肺癌 560例A 肺部良性疾病 350例A 健康人 150例A,动态监测研究 非小细胞肺癌 100例B 50例C,对比研究 肺癌 100例D 肺部良性疾病 50例D 健康人 50例D,肿瘤特异性研究 其他肿瘤 150例A,CytoploRare（FR靶向PCR CTC检测） 临床试验设计（1210例, 最大样本量）,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015,36,患者特征,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015,不同CTC计数对于肺癌诊断的特异性与敏感性,CytoploRare（FR靶向PCR CTC检测） 叶酸受体阳性CTC作为诊断标志物,38,最大样本量CTC检测数据 Cutoff： 8.70 CTC Units/3mL 敏感性：79.6% 特异性：88.2%,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2013; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015,AUC: 0.8797,CytoploRare（FR靶向PCR CTC检测） 所有肺癌，敏感性提高3倍；I期肺癌提高10倍,CTC对肺癌的诊断显著优于一般肿瘤标志物,CTC与一般肿瘤标志物对肺癌诊断的准确性（AUC值）,单项CTC检测的辅助诊断价值优于多个一般肿瘤标志物联合,AUC=0.91, P0.0001,AUC=0.76,不同病理类型中，CTC辅助诊断价值均优于一般肿瘤标志物,CTC对期肺癌的阳性检出率高达67.2% 其他最优的肿瘤标志物的敏感度仅为32.3%,1cm肺癌总体敏感性: 62.5%,CTC联合CT可以大大提高小结节诊断的特异性 CTC辅助CT可以将小结节的判别假阳性率降低到10%,Lou JT, Wang L, et al In submission,上海市胸科医院：病例一,VATS右肺上叶切除术：右肺上叶细支气管肺泡癌（非粘液性），T1aN0M0， 直径0.8cm,VATS右肺上、中叶切除+系统性淋巴结清扫： 术后病理确诊：右上叶腺癌（非粘液性）、细支气管肺泡癌及肺泡样混合亚型，高分化， T1aN0M0 肿瘤大小：0.5*0.7*0.4cm,上海市胸科医院：病例二,CTCs：可反应肿瘤发生发展的功能状态,Cancer Control, 2015,肺癌辅助诊断 降低胸部CT假阳性率，减少肺癌漏诊 肺癌化疗疗效评估 评估肿瘤功能活性状态，弥补RECIST标准不足,CTC：用于化疗疗效评估，先于肿瘤大小发生变化，评估肿瘤功能状态,NSCLC, 1st-line carboplatin, paclitaxel (d); NSCLC, 2nd-line pemetrexed(e) Baseline CT scans were before therapy initiation and CTC measurements began at or shortly after the first treatment.,CTC数量变化与RECIST标准基本一致,相同SD患者，CTC下降患者PFS可能更长,1210例受试者,肺癌