热烈欢迎各位 莅临本次学术讲座,http:/www.yrbio.com,MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略 主办：湖南省生物医学信息专业委员会 湖南省赢通基因与细胞工程技术研究中心 生物医药科研网 承办：赢润生物 重庆迈凯科技有限公司 能润医学,MicroRNA研究策略,赢润生物 2011年12月,http:/www.yrbio.com,讲座主线,MicroRNA简介 MicroRNA的检测 MicroRNA的过表达 如何下调MicroRNA MicroRNA靶基因验证实验 MicroRNA相关SCI论文实例,http:/www.yrbio.com,一. MicroRNA简介,MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷 酸的小RNA。其在细胞内具有多种重要的调节作用。 网状作用模式：每个miRNA可以有多个靶基因，而几个 miRNAs也可以调节同一个基因。 据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。 miRNA数据库：www.mirbase.org,http:/www.yrbio.com,两个概念： pri-miRNA pre-miRNA Mature miRNA miRNA的种子序列（seedsequence）： 成熟miRNA 的5端的第28位核苷酸与 靶mRNA 3端的非翻译区（UTR）部分 序列的结合很重要，被称为种子序列。,http:/www.yrbio.com,http:/www.yrbio.com,二. MicroRNA的检测,MicroRNA芯片 优点：高通量 缺点：成本高； 难区分前体miRNA和成熟 miRNA Northern blot 优点：能比较直观的反映miRNA的表达量高低 缺点：步骤复杂； 难区分前体miRNA和成熟 miRNA,http:/www.yrbio.com,miRNA qPCR检测（Real-time PCR） 优点：可区分前体miRNA和成熟 miRNA； 检测灵敏度高； 高特异性； 成本较低 难点：Mature miRNA很短，如何检测？ 解决方法：加长序列,http:/www.yrbio.com,miRNA qPCR检测：Stem-loop法,http:/www.yrbio.com,miRNA qPCR检测：Poly A加尾法,http:/www.yrbio.com,Stem-loop法 优点：特异性高 缺点：每做一次RT，只能检测一个miRNA 代表厂家：ABI、Ambion Poly A加尾法 优点：通用性高；一次RT可以检测多个miRNA 缺点：特异性稍差 代表厂家：Qiagen,http:/www.yrbio.com,三. MicroRNA的过表达,pri-miRNA pre-miRNA Mature miRNA,载体形式,载体形式,化学合成：mimics,CMV启动子,600bp,转染效率高,可长期表达,可带荧光,U6/H1启动子,70600bp,可带荧光,可长期表达,转染效率高,miRNA成熟序列,价格较高,价格较高,可进行各种修饰,可带荧光,作用时间短,转染效率有时较低,价格较低,http:/www.yrbio.com,pri-miRNA结构： CMVp-EGFP-pri-miRNA-Poly A pre-miRNA结构： hU6p-pre-miRNA-TTTTTT 人工pri-miRNA结构： CMVp-EGFP-mir30左臂-pre-miRNA-mir30右臂-Poly A,http:/www.yrbio.com,pYr-pri-miRNA构建用载体,http:/www.yrbio.com,pYr-pri-miRNA范例,http:/www.yrbio.com,pYr-pri-miRNA范例,http:/www.yrbio.com,pYr-pri-miRNA构建用载体,http:/www.yrbio.com,pYr-pri-miRNA范例,http:/www.yrbio.com,pYr-pri-miRNA范例,http:/www.yrbio.com,pYr-pri-miRNA范例,http:/www.yrbio.com,pYr-pri-miRNA范例,http:/www.yrbio.com,人工pri-miRNA范例,http:/www.yrbio.com,Tips：pri-miRNA过表达，miRNA能够提升多少？ （1）如果目的细胞中已有miRNA的高表达： 大约提升25倍。 （2）如果目的细胞中目的miRNA低表达或无表达： 大约能提升501000倍。,http:/www.yrbio.com,四. 如何下调MicroRNA,如何下调miRNA，实现loss-of-function研究？ （1）化学合成的miRNA antisens oligo。 优点：比较经济；合成时间较短 缺点：作用时间短；转染效率受限制,http:/www.yrbio.com,（2）载体形式的miRNA inhibitor。 优点：可长期稳定作用；转染效率高 缺点：构建周期较长,http:/www.yrbio.com,如何构建载体形式的miRNA inhibitor,方法一：miRNA sponge,http:/www.yrbio.com,miRNA sponge作用效果,http:/www.yrbio.com,如何构建载体形式的miRNA inhibitor,方法二：miRNA Decoy（TuD RNAs）,http:/www.yrbio.com,http:/www.yrbio.com,miRNA Decoy作用效果,http:/www.yrbio.com,五. MicroRNA靶基因验证实验,promoter,报告基因,miRNA靶序列,CMVp,SV40p,TKp,Rluc,Fluc,EGFP,全段3UTR,部分3UTR,-gal,http:/www.yrbio.com,http:/www.yrbio.com,http:/www.yrbio.com,检测方法 （1）miRNA靶标载体、 内参荧光素酶载体、 miRNA mimics或miRNA过表达载体 共转染。 （2）带有内参荧光素酶的miRNA靶标载体、 miRNA mimics或miRNA过表达载体 共转染。 然后做双荧光素酶检测实验。,http:/www.yrbio.com,进一步确定目的miRNA和靶基因之间的关系 （1）构建含突变靶位点的miRNA靶标载体。 其它步骤同前。 （2）靶基因表达检测： 目的miRNA上调或下调过程中，靶基因表达量的 变化情况。,http:/www.yrbio.com,机制研究,目的miRNA,靶基因,细胞表型,下游基因,http:/www.yrbio.com,六. MicroRNA相关SCI论文实例,SCI论文实例一 影响因子：2.8,http:/www.yrbio.com,第一步：通过预测软件选取待选miRNA（58个）,http:/www.yrbio.com,第二步：构建待选miRNA的过表达载体,http:/www.yrbio.com,http:/www.yrbio.com,http:/www.yrbio.com,第三步：双荧光素酶检测实验,http:/www.yrbio.com,http:/www.yrbio.com,第四步：miRNA对目的基因表达量的影响,http:/www.yrbio.com,第五步：进一步验证miR-503与CCND1的关系,http:/www.yrbio.com,http:/www.yrbio.com,细胞表型水平的验证：,http:/www.yrbio.com,http:/www.yrbio.com,SCI论文实例二 影响因子：8.15,http:/www.yrbio.com,第一步：发现组织和细胞中miR-205表达差异,http:/www.yrbio.com,第二步：过表达miR-205，发现细胞增殖受到抑制,http:/www.yrbio.com,http:/www.yrbio.com,miR-205表达上调后，肿瘤细胞的侵袭能力下降,http:/www.yrbio.com,第三步：选择靶基因，双荧光素酶检测实验,http:/www.yrbio.com,http:/www.yrbio.com,第四步：miR-205上调对靶基因表达量的影响,http:/www.yrbio.com,SCI论文实例三 影响因子：28,http:/www.yrbio.com,第一步：针对目的基因，选择待选的miRNA（软件）,http:/www.yrbio.com,最终选定miR-101作为研究对象,http:/www.yrbio.com,第二步：进一步实验验证miR-101和EZH2之间的关系 （1）双荧光素酶检测 （2）过表达miR-101及其它几种miRNA，检测EZH2表达,http:/www.yrbio.com,http:/www.yrbio.com,Western-blot检测,http:/www.yrbio.com,第三步：研究miR-101、EZH2、细胞表型之间的关系 细胞增殖：,http:/www.yrbio.com,肿瘤细胞侵袭能力,http:/www.yrbio.com,成瘤实验,http:/www.yrbio.com,第四步：机制研究,http:/www.yrbio.com,http:/www.yrbio.com,第五步：结论,http:/www.yrbio.com,MicroRNA研究思路之一,MicroRNA芯片检测,miRNA qPCR检测,Northern检测,确定欲研究的miRNA,选择作用的靶基因,靶基因验证实验,基因表达检测,细胞表型检测,miRNA上调或下调,组织或细胞,http:/www.yrbio.com,MicroRNA研究思路之二,确定目的基因,miRNA qPCR检测,Northern检测,确定欲研究的miRNA,确定若干个目的miRNA,microRNA芯片检测,miRNA上调或下调,靶基因验证实验,基因表达检测,细胞表型检测,http:/www.yrbio.com,赢润生物：www.yrbio.com,http:/www.yrbio.com,数万个cDNA克隆和ORF克隆； 六百多种常用载体及菌株；几十种启动子 数据尚未完全录入，请QQ、Email或电话咨询。,基因库：www.yrgene.com,http:/www.yrbio.com,赢润生物技术支持 基因库、载体库、RNA干扰、病毒包装： 孙永林（手机：15574926881；QQ：12695920；Email：serviceyrgene.com） 分子生物学、细胞生物学、蛋白质及免疫学： 刘彩云（手机：15973165383；QQ：15887251；Email：orderyrbio.com) 赢润技术服务重庆独家代理商重庆迈凯科技有限公司 邓显锋 （手机：13036393306 QQ：285818066 ） 周辉云 （手机：13102370501 QQ：78904388 ） 唐 港 （手机：13618257190 QQ：492268569 ） 电话：023-63245915 Email：biotree163.com,欢迎您垂询！,http:/www.yrbio.com,Thanks!,