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第九章 血清学反应,第一节 概 述,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,2,一 血清学反应的概念及一般特点,抗原及相应抗体在体内或体外均能发生特异性结合,在体外结合能发生可见免疫反应。由于抗体主要存在于血清中,故称为血清学反应。 血清学反应根据抗原性质、反应条件、参与反应物质,则表现出反应有多种多样。其反应的一般特点是:,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,3,(一)特异性和交叉性 血清学反应具有高度特异性。由于抗原决定簇的组成、结构以及排列不同,所诱导产生的抗体也不同。抗原只能与相应抗体结合,而不能与其他抗体相结合。 生物体的组成是复杂的,包含有多种抗原成分,在进化过程中形成不同的种类,有各不相同的特异性抗原,在亲缘种系中往往含有部分相同的抗原成分,能引起交叉反应。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,4,(二)结合的可逆性 抗原抗体结合是分子表面结合,这一结合受理化因素的影响,当温度超过60C或pH降至3以下时,则抗原抗体复合物又重新离群。离群后的抗原、抗体,其理化性质、免疫活性保留。利用抗原抗体结合的可逆性,可进行免疫吸附层析,纯化抗原或抗体。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,5,(三)最适比与带现象 抗原与抗体结合,其比例适当时才可出现可见反应。当抗原抗体比例适当时,两者结合后,尚有未饱和的结合点,可以继续与游离的抗体、抗原或与抗原抗体的结合物的未饱和点相联结,逐渐形成愈来愈大的复合物,出现了肉眼可见反应。比例最适合,出现反应最快,反应产物愈多。 如果抗原或抗体过多,抗体和抗原结合点的聚合一开始时即达到饱和,形成小的复合物则不能继续与相邻抗原、抗体结合,不出现可见反应,谓之区带现象或带现象。为了避免血清学反应的带现象,需要将抗原或抗体作适当的稀释。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,6,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,7,比例不适合不能完成第二步反应 带现象,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,8,(四)反应的阶段性 抗原与抗体进行结合,可分为两个阶段: 第一阶段为抗原与抗体的特异性结合阶段,反应快,几秒钟至几分钟即完成,但无可见反应; 第二阶段为抗原与抗体的反应可见阶段,表现为凝集、沉淀、补体结合等,反应进行较慢,需几分钟或更久。第二阶段受电解质、温度、pH值等影响。两个阶段在反应进行中无严格界限。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,9,(五)影响反应的因素 1.电解质 血清学反应须在适当浓度的电解质参与下,才出现可见反应。在凝集、沉淀反应操作时,一般用生理盐水或8%10%高渗盐水作稀释,才出现较强反应。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,10,2.温度 温度升高,可增加抗原与抗体分子运动而碰撞接触,加速反应的出现,故通常将抗原抗体混合后,放置37C温箱或水浴箱中,保持一定时间,促进反应。温度高,加速反应;温度低,反应时间延长,但反应结合充分,故在补体结合反应、免疫吸附实验中,采用的低温中放置过夜。 3.酸碱度 血清学反应通常用pH68,过酸或过碱都可使复合物离群,pH值在等电点时,可引起非特异凝集。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,11,二 血清学反应的类型和参与成分 (见课本表9-1) 三 血清学反应的应用方式和目的,抗原抗体反应是特异性的,在应用时必须有一个是已知的,通过反应来鉴定另一个未知的。例如鉴定某一病原微生物时,多用已知抗体。诊断传染病时,对慢性病可用已知的抗原检测未知的特异性抗体;诊断急性病则用已知的抗体检测未知的抗原(病原),如炭疽病等。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,12,(一)抗原与抗体的快速检测 在诊断传染病、寄生虫病、变态反应、肿瘤、自身免疫疾病时,均已广泛应用血清学方法检查抗体或抗原(细菌、病毒)的存在,作为诊断疾病的手段。现已应用的间接血凝技术、对流电泳、标记抗体技术,均能快速、简便的确诊抗原或抗体。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,13,(二)生物活性物质的超微定量 应用酶联免疫吸附实验、放射免疫等技术,抗原抗体检测的敏感度均大为提高,已达到能精确测出Pg的水平,其敏感度已大大超过了常规的化学分析。此类技术已应用于测定动物体内的激素、维生素、药物及其他病理过程中的微量产物。 (三)抗原或抗体在细胞与亚细胞水平的定位 用荧光抗体、酶标抗体技术,可以检测病毒或细菌在动物各种组织细胞中的分布。应用免疫酶组化法及铁蛋白标记技术进行免疫电镜观察,可以测定病毒在亚细胞水平的定位,也可测定淋巴细胞表面免疫球蛋白及抗体的产生情况。据此可分析传染病发生的机制及对免疫机理的探讨。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,14,(四)微生物的鉴定与分析 应用交叉凝集实验、凝集吸收实验、沉淀实验等血清学实验,进行微生物的鉴定及区别微生物的血清型,从而确定微生物的类型及其亲缘关系。还可应用琼脂扩散实验、免疫电泳等技术,对微生物的抗原组分进行分析。 (五)血型鉴定 用细胞直接凝集实验、血凝抑制实验、溶血实验、Coomb实验等技术,可作血型鉴定、亲子关系的确定、新生儿和出生幼畜溶血病的诊断。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,15,第二节 沉淀试验,可溶性抗原与相应抗体结合,在适量电解质存在下,形成肉眼可见的絮状白色沉淀,称之为沉淀试验。 可溶性抗原 + 免疫血清 出现沉淀现象 (病毒等) (抗体) 比例适合 沉淀原 沉淀素 比例不适合 无沉淀现象 容易过多 前带现象,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,16,一 液相沉淀试验 1环状沉淀试验 原理:小试管内,下层沉 淀素与上层沉淀原 在液界面应形成白 色沉淀环。 用途:检测皮毛中的炭疽 杆菌抗原(Ascoli试验) 2絮状沉淀试验 抗原与抗体在试管内混合,在电解质的存在下抗原抗体复合物可形成絮状凝聚物。此法多用于毒素和抗毒素测定。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,17,二 琼脂扩散试验,琼脂是一种含有硫酸基的多糖,加热溶解于水,冷却后凝固成凝胶,琼脂凝胶是一种多孔结构,其孔径大小与琼脂含量有关,1%琼脂凝胶孔径为85nm,能使许多可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散。当抗原与抗体在凝胶中的一定位置上相遇时,则两者结合形成沉淀线。沉淀线的位置与抗原、抗体颗粒的大小、浓度,沉淀线的数目和所含抗原组分有关。琼脂扩散可分为单扩散(抗原或抗体中一种成分扩散)和双扩散。 根据其扩散的方向可分为单向单扩、单向双扩、双向单扩、双向双扩,其中双向双扩应用最广。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,18,1 单向单扩散,亦称Oudin。将0.6%-1%琼脂加热熔化后,加入定量经预热的稀释抗血清,混合均匀后,加入小试管中,待凝固后加入0.5ml抗原于其上,直立,置于37C中,2-3h后出现沉淀线。由于抗原的扩散,使沉淀线不断向下推移,而最初形成的沉淀带随抗原的扩散而向下推移,最后稳定。沉淀带距抗原愈近,其浓度愈大,可作抗原浓度测定。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,19,2 单向双扩散 亦称Oakley。基本作法同上,但在抗原与抗体之间加一层不含抗体的盐水琼脂,抗原与抗体均向中间琼脂扩散,形成沉淀带。主要用于抗原成分的分析。 3 双向单扩散 亦称辐射扩散。在平皿或玻板上进行。用2%缓冲琼脂盐水,加热融化,待冷后加入经预热的抗血清(用1:5-10倍稀释),混合后倒入平皿或玻板上,厚2-3mm。凝固后在凝胶板上打孔,孔径2-3mm,孔内滴加抗原液,放置湿盒中37C下扩散。抗原在孔内向四周扩散,与凝胶中的抗体接触,形成白色沉淀环,白环的大小随抗原的浓度而增大。此法在兽医临床上用于蛋白质定量实验。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,20,4双向琼脂扩散(琼扩) 此法系采用1%琼脂倒于平皿或玻片上,制成凝胶板,可 按需要打孔。将抗原、抗体分别滴入孔内,放置湿盒中,在 37C湿箱中24-72h后观察。在抗原与抗体孔间形成沉淀带。每 一种抗原成分出现一条沉淀带。 结果判断: 如两个相邻孔之间抗原 相同,则沉淀带融合;抗 原则不同,则互相交叉; 部分相同则部分融合, 另外不同部分则交叉。 特点:简便、敏感性低、耗时、应用最广 用途:常用于细菌、病毒的鉴定,抗血清效价的测定,抗原组分的分析及传染病的诊断等,如马传染性贫血病的诊断。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,21,三、 免疫电泳,琼脂扩散与电泳技术结合起来称免疫电泳。由于抗原颗粒带电荷不同,在同一电场中其泳动速度不同,故起迁移率不同,因而通过电泳可将抗原成分分开。停止电泳后加抗血清进行扩散,如有一队抗原抗体出现一条沉淀线,因而大大加强了免疫扩散的分辨率及敏感性。此法可应用于抗原成分及含量成分的分析、免疫球蛋白纯度的鉴定,以及传染病的快速诊断等。 1微量免疫电泳 用pH8.6的巴比妥缓冲液(VB液)配成1%的琼脂液,制成凝胶板。在凝胶板1/3处打孔2个,孔径2-3mm,两孔间距10-12mm。孔内滴加抗原,置于电泳槽上,两端用滤纸或纱布做桥,连接电泳液。电泳时,按凝胶板宽度测电流,电泳45min-2h。电泳完毕,滴加抗血清,进行扩散。抗原成分不同,泳动速度不同,与抗血清形成数条清晰的沉淀弧。本法用于血清成分分析及提取的Ig纯度鉴定。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,22,正常人血清蛋白的免疫图象,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,23,2对流免疫电泳 试验时在凝胶板上打孔,两孔为一组,并排打孔两组,然后加样。抗原滴入负极端孔内,抗体滴入正极端孔内,进行电泳。泳动30-90min,观察结果。在两孔之间出现沉淀带,为阳性反应。 结果判断: Ag Ab 特点:反应时间短,敏感性提高 用途:定性,已不多用(水貂阿留申病,以病原Ag检测病貂血清中的抗体),2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,24,3火箭电泳 将双向单扩散与电泳技术结合起来,其沉淀线似火箭,故称火箭电泳。 本法将琼脂融化、冷却,在融化的琼脂中加入一定量的已知抗血清,制成凝胶板。在其一端打一小列孔,分别在孔中加入待检抗原或已知抗原,放置电泳槽中,加样品端位于负极,用双层滤纸连接琼脂板的槽内缓冲液,接通电源,板端电压4V/cm,电流3mA/cm,电泳2-10h。电泳后,抗原在有抗血清琼脂板内向正极迁移,前端与抗体接触,形成火箭状况沉淀弧。在同一抗体浓度下形成峰的高低,与抗原浓度大小成正比。本法用于抗原量的测定(先用已知抗原浓度测定制成曲线)。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,25,火箭电泳图 为标本;为标准抗原,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,26,第三节 凝集试验,细菌、红细胞等颗粒状态的抗原与相应的抗体结合后,在电解质存在时相互凝集成絮片状团块,这种试验称为凝集试验(Agglutiation test)。 参与反应的抗原叫凝集原;参与反应的抗体称为凝集素,主要有IgG、IgM。凝集实验有直接凝集试验和间接凝集试验两种。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,27,基本原理: 生理盐水 颗粒性抗原 + 相应抗血清 抗原颗粒凝集 (细菌、红细胞) 比例适合 凝集原 凝集素 过多 后带现象 (稀释血清) 一、直接凝集试验 颗粒性抗原与相应抗体在电解质的参与下,直接结合,凝集成团的现象,称直接凝集试验。按其操作方法可分为玻片发和试管法。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,28,1玻片凝集试验 将已知的抗血清1-2滴,滴于清洁玻片上,取待检菌液(抗原)加于其上,混合均匀,数分钟后可出现颗粒状或絮片状凝集,谓之阳性反应。 特
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