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三萜皂苷类成分的抗衰老作用与质量分析研究,一三萜皂苷的研究概况,三萜皂甙是由六个异戊二烯以头尾相接或尾尾相接而组成,一般由含30个碳原子。按其皂甙元,可将三萜皂甙分为五环三萜(pentacylic triterpennoids)和四环三萜(tetracylic triterpennoids)两大类。 五环三萜皂甙数目较多,又可分为七种类型:齐墩果烷(oleanane)型、羽扇豆烷(ursane)型、木栓烷(lupane)型、异B-香树脂醇(iso-B-amyrin)型、羊齿烷(fernane)和异羊齿烷(isofernane)型、何帕烷(hopane)和异何帕烷(isohopane)型。四环三萜皂甙除含有C30外,也有C31或C32的衍生物,主要有四种类型:达玛烷(dammarane)型、羊毛脂烷(lanostane)型、大戟烷(euphane)型、葫芦烷(cucurbitane)型。,三萜皂甙在植物界有较广泛的分布,据报道在104科1730种植物中,含有皂甙的植物就约有79 科860 种,其中含有三萜皂甙的植物就约有627 种。 三萜皂甙在双子叶植物中分布较为普遍,较多种的科有五加科、伞形科、夹竹桃科、菊科、石斛科、葫芦科、大戟科、豆科、桃金娘科、远志科、毛莨科、蔷嶶科、茜草科等;单子叶植物含三萜皂甙的植物较少见,仅见于禾本科的少数属;裸子植物及低等植物中也较少含有这类皂甙;另外在海洋生物如海参、海星、海盘车等中亦有存在。,许多常见中药中含三萜皂甙,如人参、三七、甘草、西洋参、地榆、款冬花、酸枣仁、紫菀、桔梗、柴胡、远志、黄芪、威灵仙、商陆、白头翁等。 皂甙类成分具多种生理活性,如刺激黏膜,已往常用作祛痰药,如桔梗、远志、紫菀中的皂甙等。经研究发现三萜皂甙还具有促进核酸蛋白质合成和胆固醇脂代谢、抗炎、抗菌、抑制肿瘤、抗溃疡、兴奋或抑制中枢神经、抑制胃液分泌以及杀死精子、软体动物等作用。,目前对天然药物的抗衰老作用,多从其对免疫功能、神经系统、内分泌系统、物质代谢、抗衰老自由基、延长细胞和动物的寿命、抗肿瘤、强壮、延长生长期等方面的作用来评价。 而不少皂甙具有上述作用,特别是三萜皂甙的活性更显著。如人参、西洋参、三七和绞股蓝等是常见具抗衰老作用的天然药物。它们均富含三萜类达玛烷型皂甙。,达玛烷型皂甙除了上述活性外,在血压、血糖等项指标上,还具有明显的双向调节作用。这一种特性对抗衰老药物来说颇为有益的,它可使发病失去某种平衡的机体恢复新的动态平衡,所以这类成分的研究倍受关注。 另外报道在约6科28种植物含有达玛烷型皂甙,从中寻找出有效的抗衰老药物是完全可能的。,二三萜皂苷抗衰老作用,A. 人参皂苷 1. 有网状内皮系统吞噬功能激活效果;对特异性和非特异性免疫功能有刺激作用。 2. 可提高小鼠对常压、低压缺氧的耐力,并可延长常温、高温负荷下游泳时间。 3. 有中枢兴奋作用,能激发人学习和记忆能力,增减智力和操作能力。 4. 具有兴奋垂体-肾上腺皮质功能的作用,5. 有性腺激素样作用;有雄性激素样作用,能使小鼠精囊腺增重。 6. 能促进DNA、RNA、蛋白质和脂肪酸的合成,使白蛋白和丙种球蛋白的含量增加。 7. 对肾上腺素高血糖的抑制作用较强。并显示对动物血糖水平有双向调节作用。 8. 可明显抑制中、老年大、小鼠的脂质过氧化作用。可延长细胞生长天数。,B. 三七皂苷,1. 可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数。 2. 对未成年小鼠体重增加有明显促进作用;可增强小鼠耐高、低温能力。 3. 能显著降低老年大鼠脑组织脂褐质及血清过氧化脂质总含量。 4. 有雄性激素样作用,能使小鼠精囊腺增重。 5. 有促进小鼠肝、肾DNA及血清蛋白质合成的作用。 6. 可明显抑制中、老年大、小鼠的脂质过氧化作用。 7. 总皂苷抗血栓。,C. 西洋参皂苷,1. 能降低ACTH引起的小鼠胸腺及脾脏的萎缩。 2. 可增强机体对缺氧的耐受力,延长小鼠负重游泳时间。,D 绞股蓝皂苷,1. 能明显提高小鼠游泳的体力和耐力,并咳提高常压缺氧的耐受力。 2. 能促进小鼠生长发育,增强小鼠耐高温、抗疲劳的作用。 3. 能预防地塞米松引起的肾上腺皮质激素、血浆皮质醇减少。 4. 可预防地塞米松引起的胸腺萎缩。 5. 对喂高蔗糖、高脂的大鼠所致的高脂血症有效。 6. 能增加自由基损伤模型大鼠和老年大鼠红细胞中SOD的活力。 7. 对肝、子宫、肺等癌细胞增生的抑制率为20%-80%;对S180有明显的抑制作用。,E 黄芪皂苷,1. 黄芪甲苷有促进B细胞增生、分化和浆细胞抗体合成作用。 2. 黄芪甲苷、绵毛黄芪苷均可对抗CCl4所致的小鼠死亡;使小鼠红细胞内SOD活性升高。,F商陆皂苷,1. 商陆皂苷甲可显著减少羊红细胞致敏血清溶血素的含量。 2. 商陆总皂苷有对抗羟基脲所致小鼠体重下降、耐寒力低下的作用。,G酸枣仁皂苷,1. 酸枣仁总皂苷能显著降低正常大鼠血清胆固醇和LDL-C,显著升高HDL-C。 2. 可显著降低高脂饲养大鼠的血清甘油三酯。 3. 酸枣仁皂苷B能增强N神经因子作用。,H. 龙牙楤木皂苷,1. 可使小鼠游泳时间显著延长,增强小鼠耐缺氧、抗低温作用。 2. 对KCN、NaNO2引起的中毒性缺氧小鼠有保护作用。,I大豆皂苷,1. 对链脲霉素所致糖尼尿病大鼠可降低血糖水平,提高SOD含量,降低脂质过氧化物。 2. 对预防高脂肪食物造成的高脂血症有作用。 3. 有降低抗肿瘤抗生素阿霉素所致心肌中过氧化脂质的上升。,K独一味皂苷,1. 能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数、E-花环形成率及酯酶染色阳性率。 2. 对Hepa、EC瘤株均有一定的抑制作用。,L土贝母皂苷,1. 能抑制人体早幼粒细胞白血病细胞(HL60)的生长。 2. 可使酵母多糖微粒的吞噬功能明显增加。,M柴胡皂苷,1. 柴胡总皂苷可促进大鼠促肾上腺皮质激素、皮质酮的分泌。 2. 柴胡皂苷d对小鼠艾氏腹水癌有抑制肿瘤生长作用,且能明显延长动物的生存时间。,三. 三萜皂苷的主要含量分析方法,中药及其制剂中三萜皂苷的含量分析可分为: 总皂苷测定 皂苷元测定 单体皂苷测定,总皂苷测定: 1. 提取:一般需要适当的溶剂提取。由于皂苷在极性溶剂中溶解度较大,提取溶剂可为各种浓度的甲醇、乙醇和异丙醇、丁醇、戊醇。 2. 精制:水饱和的正丁醇萃取;大孔树脂处理后溶剂洗脱。 3. 测定:最常用的方法为比色法,也有用重量法的。,皂苷元测定: 提取:1先用上述方法得到总皂苷,再加酸(如硫酸、盐酸)加热水解,得皂苷元。 2将样品先行水解,再用有机溶剂从水解的混合液中提取皂苷元。 测定:主要有薄层色谱法、高效液相色谱法和比色法。 单体皂苷测定:主要为薄层色谱法和高效液相色谱法。,(一) 比色法,皂苷类成分多无色,且常无紫外吸收。 含量测定时常需显色, 产生颜色-于可见光区比色测定 在紫外光区产生吸收-用紫外分光光度法测定。 皂苷类成分的颜色反应的专属性虽较差,但反应比较灵敏,方法简便,易行。,常用的显色剂有: 浓硫酸 高氯酸 硫酸-醋酐、硫酸-醋酐-冰醋酸或硫酸-冰醋酸 芳香醛-硫酸或芳香醛-高氯酸 其它试剂:对-二甲氨基苯甲醛,亚甲蓝等,(二) 薄层色谱法,1. 薄层条件 (1) 吸附剂:硅胶,氧化铝 (2) 展开剂:皂苷;皂苷元 (3) 显色剂:25%磷钼酸乙醇溶液 硫酸:甲醇(1:1) 氯磺酸:醋酸(1:2) 碘蒸气,2. 含量测定方法: (1) 薄层-比色法 人参皂苷元的薄层-比色法测定 标准曲线:对照品为人参皂苷元(人参二醇、人参三醇、齐墩果酸),加5%香草醛-冰醋酸、高氯酸;再加醋酸,在560nm测定,做三条标准曲线 样品测定:硅胶G,条状点样;氯仿-甲醇-水(60:42:11 碘蒸气显色;刮取斑点范围硅胶,显色测定。测定三组皂苷的吸收度,分别于标准曲线中查得相应数值,乘以2.5、1.77与2.1倍,计算各组皂苷含量,(2) 薄层扫描法 A.人参单体皂苷薄层扫描法测定 样品制备:甲醇,冷浸-热回流 对照:人参皂苷Ro、Rb1、Rb2、RC、Rd、Re、Rg1、Rg2 扫描条件:s=525nm,R=760nm;投射法线性 样品测定:GF254板, 显色剂为10%硫酸,115,10min 氯仿-甲醇-水(13:7:2)测定Ro、Rb1、Rg1、Rg2 正丁醇-醋酸乙酯-水(4:1:1)测定Rb2、RC、Rd、Re,B.三七中皂苷薄层扫描法测定 对照品:三七皂苷C1、D1、D2、E 扫描条件:s=525nm,R=700nm;反射法线性 样品测定:硅胶G板,显色剂为碳酸氢钠-无水乙醇 展开剂为1,2-二氯乙烷-正丁醇-甲醇-水(30:40:15:25,下层),(三) 高效液相色谱法,关键问题是测定条件和流动相的选择。 1. 测定条件选择 多无共轭体系(少数除外),通常利用末端吸收作为测定波长。 也可用示差折光检测器; 新近用蒸发光散射检测器(Evaporative light scattering detector,ELSD),蒸发光散射检测器(ELSD)是一种通用型检测器,流动相由热气流使之热气化喷雾,再进入加热管,溶剂在此挥发。所得分析检测的物质颗粒通过一狭窄光束散射光,由光电倍增管收集。ELSD的响应取决于被分析物质颗粒的数量和大小。由于ELSD仅对不挥发被分析物质产生响应,即使是在梯度洗脱时也能提供平稳的基线。 ELSD已成功用于皂甙、生物碱、萜类内酯、氨基酸和糖类等分析。是分析无紫外吸收及紫外吸收弱成分的有力工具。,2. 流动相的选择 皂苷类成分多用反相色谱柱。 常用流动相有乙腈、甲醇、纯水等。 对溶剂要求较高,最好是色谱醇。,四. 三萜皂苷的质量分析研究,(一) 三七中三萜皂苷的定量分析 三七为五加科植物三七Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen的干燥根。功能散瘀止血,消肿定痛。 现代药理研究证明,三七中皂甙类成分为其活性成分。为了更好地对三七药材进行质量评价和制定更完善的控制指标,采用HPLC-ELSD对其主要皂甙人参皂甙Rg1、三七皂甙R1进行了含量测定,并用紫外分光光度法测定了总皂甙的含量。,三七中皂甙类成分的含量测定可采用HPLC-UV及HPLC-RI法。前者用紫外检测器=203nm检测,因三七中皂甙类成分紫外吸收较差,受试剂影响很大,基线漂移大,使分析很难进行。后者用示差检测器,则灵敏度低,稳定性和选择性均较差。本文用ELSD检测器测定三七中主要皂甙人参皂甙Rg1的含量,因ELSD检测器为质量型检测器,且不受外部环境的干扰,试剂在检测器中全部蒸发,不干扰检测,灵敏度及稳定性均符合含量测定的要求。,A三七中总皂苷的含量测定,1供试品溶液的制备: 取本品粉末约0.5g,精密称定,置索氏提取器中,加乙醚80ml,置水浴上提取2h,弃去乙醚液,再加甲醇80ml提取4h,甲醇提取液蒸干,残渣加水15ml使溶解,水溶液置分液漏斗中,用水饱和的正丁醇萃取5次,每次15ml,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇溶解,定溶至50ml,作为供试品溶液。对照品溶液为人参皂甙Rg1(5mg/100ml)。,2紫外吸收光谱: 仪器为岛津UV-2501pc紫外分光光度计;供试品紫外吸收曲线及最大吸收波长268nm与人参皂甙Rg1标准品完全一致,3标准曲线制备: 分别精密吸取对照品溶液0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml置10ml量瓶中,置水浴中挥尽溶剂,取出,加浓硫酸0.6ml,摇匀,置80水浴中加热1h,取出,置冰浴中加95%乙醇至刻度,摇匀,在268nm波长处测定吸收度。 以吸收度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。经回归统计,得标准曲线方程:A=39.6856C+0.0148,r=0.9996。 浓度在5.04-25.20g/ml范围内,与吸收度呈线性关系。,4方法学考察: 回收率试验回收率为101.15%,RSD=1.44%;稳定性试验RSD为1.35%,总皂甙在
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