肿瘤侵袭、转移实验技术 首都医科大学 2015.11 目录 一、概述 二、细胞划痕实验 三、 Transwell 四、裸鼠尾静脉注射实验 五、总结 一、概述 肿瘤侵袭和转移 体外 体内 细胞划痕实验 Transwell 裸鼠尾静脉注射 二、细胞划痕实验 细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的迁移能力。 实验优点： 1.在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。 2.适合研究细胞与胞外基质（ ECM）、细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。 3.与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用。 4.研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。 二、细胞划痕实验 实验材料： 细胞样品 仪器、耗材： 6孔板 marker笔 直尺 枪头 试剂、试剂盒：无血清培养基、 PBS 二、细胞划痕实验 1.所有能灭菌的器械都要灭菌 2.超净工作台 紫外线消毒 30min 注：需要灭菌的器材包括 离心管 、 吸管筒 、 移液枪 、 枪头 等 二、细胞划痕实验 4.每孔加入 5X105个细胞并培养约 24h 注： 1.数量以过夜贴壁能铺满为宜，适当调整 2.数量少时可培养一段时间至铺满板底 （ 3. 6孔板背面画线 5-6条） 二、细胞划痕实验 5.用 1ml枪头垂直于孔板和线制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致 注： .人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法最大的缺陷 二、细胞划痕实验 6.吸掉旧培养基，用无菌 PBS冲洗细胞3次，去除划下的细胞后，再 加入无血清培养基，根据需要设加实验组、对照组。 注：冲洗时温柔，贴壁加入，避免冲掉单层细胞 二、细胞划痕实验 7.放入 37度 5%CO2培养箱，培养。按 0，（ 6）， 12， 24小时取样，拍照。 8.计算、比较、分析 image J 软件计算每个视野的划痕面积 http:/www.wimasis.com/en/ 二、细胞划痕实验 新：德国 IBIDI（易必迪）技术 1.准备细胞，培养液， culture Insert。 2.将细胞接种于 Dish中间的 Insert，培养。 3.细胞长满 Insert 区域后用镊子移除 Insert即可产生 500 m宽度的划痕。 4.每隔 4-6小时拍照记录。 5.根据收集图片数据分析实验结果 二、细胞划痕实验 谈几点问题： 1.细胞的选择：一般适用于上皮，纤维样细胞系 a.本身有迁移能力，且较强。 b.有极性，方便测量，观察。 c.对无血清有较强的忍受力。 2.观察的时间：一般为 0、 6、 12、 24h a.时间太久，无血清，易死亡，相对坚强 b.时间太久，细胞繁殖，假阳性 二、细胞划痕实验 三、 Transwell Transwell是一种应用 Transwell 小室来探究细胞共培养 、细胞趋化 、细胞迁移 、细胞侵袭等的问题的实验技术。 三、 Transwell Transwell小室：常用 8.0um膜，铺胶 130rmb、不铺胶 40rmb，可重复利用 上层培养液：无血清培养基，为维持渗透压，需加入 0.05%-0.2% BSA 细胞：有侵袭能力细胞 先撤血清让细胞饥饿 12 24h，再进行实验 材料准备及说明： 三、 Transwell 基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel 下层培养液：含 5% 10% FBS的培养基， 也可用趋化因子 细胞培养板： 6孔板、 12孔板、 24孔板等， 以 24孔最常用 材料准备及说明： 三、 Transwell 1.Transwell小室制备 包被基底膜：用 50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被 Transwell小室底部膜的上室面， 4 风干 水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入 50ul含 10g/LBSA的无血清培养液， 37 ， 30min。 三、 Transwell 2.取细胞悬液加入 Transwell小室，24孔板小室一般 200l。细胞密度为 1 10 105个 . 3.24孔板下室一般加入 500l含 FBS或趋化因子的培养基 。 三、细胞划痕实验 4.培养细胞：常规培养 48h，具体调整 5.结果测定： 直接测定：细胞染色，镜下计数 间接测定： MTT法、荧光试剂检测、结晶紫染色 问：某药可抑细胞侵袭， 24h后可抑制细胞增殖，可以培养 36h看结果吗？ 三、 Transwell 直接观察： 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 染色：推荐采用 0.1%结晶紫固定染色。 细胞计数：把小室反过来直接观察或把膜切下直接染色，取若干个视野计数细胞个数 问：、先后问题？ 三、 Transwell 间接观察：结晶紫法 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 染色：推荐采用 0.1%结晶紫固定染色。 染色后可以用 33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm 测其 OD值，间接反映细胞数。 四、裸鼠尾巴静脉注射 小鼠肿瘤转移模型分类： 1.人工转移模型：将肿瘤细胞体外培养株或腹水等行注射，在肺 (尾静脉注射 )、脑 (颈动脉注射）肝脏 (肝动脉注射）等部位观察 2.自发转移模型：肿瘤细胞接种在小鼠腋部或足趾的皮下、腹腔肌肉或原组织中，观察转移灶。 四、裸鼠尾巴静脉注射 1.裸鼠的选择： 4-6周裸鼠、价格约100+rmb 2.细胞的选择：查阅文献，选择合适细胞株； 细胞浓度：具体不定，动物肿瘤一般接种 2 600万 /只就 100%成瘤，而人癌则需要 1000万以上才能较高的成瘤 四、裸鼠尾巴静脉注射 3.注射技巧： 固定： 50ml离心管自制或购买成品 注射位置：鼠尾部侧面的 2条静脉，一般在尾部远端的 1/3到 1/2处进针。 注射：选择 1-2ml注射器，针头采用 4号或 4.5号。 凸显静脉：温水，烤灯等 四、裸鼠尾巴静脉注射 问：如何判断已经注射进入： 注射到静脉的推液几乎没有阻力，可快速将液体推完通常 600ul可在 10秒推完。如果注射到静脉以外，强行推液，阻力较大，注射处周围会出现露水样渗液，而且出针后，出血较少。 并且由于药液瘀阻在尾部，导致血流不畅，尾部缺血，易导致尾部炎症和坏死。 四、裸鼠尾巴静脉注射 4.观察结果： 影像； 大体解剖测量； 组织切片染色 如何算一个完整的实验？ 五、总结 细胞划痕实验 transwell 裸鼠尾静脉注射 谢谢！ 首都医科大学 2015.11