医学论文-家兔胆石模型肝组织固醇携带蛋白 2 表达的意义作者：张淑坤 崔乃强 李东华 崔云峰 张西波【摘要】 目的：复制家兔胆固醇结石模型，检测模型家兔肝组织固醇携带蛋白 2（SCP2） mRNA 的表达. 方法：健康北京大耳白家兔 16 只，随机分为2 组，每组 8 只：对照组喂普通饮食，模型组喂高胆固醇饮食（含 12 g/kg 胆固醇）. 4 wk 时剖杀动物，采用半定量 RTPCR 检测 SCP2 mRNA 在家兔肝组织的表达. 结果：对照组无结石形成；模型组成石率达 87.5%. 与对照组相比，模型组动物肝组织 SCP2 mRNA 表达升高(0.790.17 vs 0.440.07，P0.05). 结论：高胆固醇膳食致家兔胆囊结石形成时肝组织 SCP2 mRNA 表达升高. 【关键词】 固醇携带蛋白 2 成石指数 胆石模型0 引言胆囊胆固醇结石的发病机制尚不清楚. 目前认为肝脏胆固醇代谢紊乱，产生成石性胆汁，是胆囊胆固醇结石形成的首要和重要原因. 固醇携带蛋白2(sterol carrier protien2, SCP2)又称非特异性转脂蛋白（nonspecific lipid transfer protein，nsLTP）是一种 Mr 为 13.010314.8103 的可溶性碱性蛋白，存在于过氧化物酶体，线粒体，内质网和胞质中，肝脏中含量最高. 它一方面作为胆固醇和磷脂代谢的调节因子1-2，参与胆固醇的生物合成和胆固醇向胆汁酸、胆固醇酯及类固醇激素的转化；另一方面作为胆固醇转运器，参与细胞内、质膜间胆固醇的运输，并能将肝脏新合成的胆固醇直接从内质网快速转运至胆汁，因此在胆固醇结石形成中起显著作用3. 我们以往的研究发现，SCP2 在胆囊胆固醇结石患者肝组织表达升高4. 为进一步研究 SCP2 表达与胆固醇结石形成的关系，我们采用高胆固醇膳食诱发家兔胆囊胆固醇结石模型，检测了家兔血清脂质成分、胆囊胆汁成分及成石指数（lithogenic index，LI）和肝组织 SCP2 mRNA 表达，以期阐明 SCP2 基因转录在胆固醇结石形成中的作用.1 材料和方法1.1 材料健康北京大耳白家兔 16 只，体质量 1.62.2 kg，34 月龄，雌雄不拘，由天津市实验动物中心提供. 胆固醇干粉系天津市光复精细化工研究所产品，由天津市实验动物中心加工成与普通颗粒饲料外观相同的含 12 g/kg胆固醇的颗粒饲料. 血脂测定试剂盒和胆汁胆固醇测定试剂盒购自北京中生北控生物科技股份有限公司. 胆汁酸测定试剂盒购自宁波市慈城生化试剂厂. 磷脂测定试剂盒购自北京利德曼生化技术有限公司. 胆汁 LI 通过 Carey 表计算5. 总 RNA 提取试剂盒购自美国 Promega 公司. RTPCR 试剂盒购自宝生物工程有限公司. 引物由上海生工生物工程有限公司合成.1.2 方法1.2.1 动物分组家兔适应性喂养 1 wk 后，随机分为 2 组,每组 8 只：对照组喂普通颗粒饲料；模型组喂含 12 g/kg 胆固醇的颗粒饲料. 动物自由进食饮水，分笼饲养 4 wk. 剖杀前禁食水 12 h，200 g/L 乌拉坦（1 g/kg）耳缘静脉注入麻醉，碘伏消毒后开腹，迅速取肝组织置-80保存；取血 5 mL；距胆囊 0.5 cm 处结扎胆囊管并切断，完整分离胆囊，连同胆囊内胆汁一起置室温备用.1.2.2RNA 提取和 RTPCR 肝组织总 RNA 提取参见试剂盒说明. 家兔 SCP2上游引物： 5GCCAACGAACTCCTCACTTAT3 ,下游引物： 5TTGCCATTCTTCACATCTACCA3 ，扩增片段 517 bp；内参选用actin ：上游引物 5GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA 3 ，下游引物 5GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG 3 ，扩增产物长度为 375 bp. 逆转录扩增参数：50逆转录 30 min，94，2 min 终止反应. 94变性 30 s，55退火 30 s，72延伸 1 min，24 个循环，循环后 72延伸 7 min. 5 L PCR 产物 20 g/L 琼脂糖电泳. 数字凝胶自动分析系统测定内参和目的基因扩增电泳带的光密度值.统计学处理：计量数据以 xs 表示，两组间均数比较采用独立样本的 t 检验，率的比较采用 Fisher 确切概率法，采用 SPSS 13.0 统计软件进行分析.2 结果2.1 胆囊结石成石情况两组动物生长良好. 对照组动物肝脏有光泽，质软，胆囊外观正常. 模型组动物脂肪肝表现：肝脏色泽变黄、变白，质地变硬；胆囊胀大，张力增高. 剖开胆囊，肉眼观察胆汁内棕黑色、成型颗粒，米粒大小；20 倍光镜下见致密大团块胆固醇结晶判定为有结石，胆囊胆汁内未见有形成分判定为无结石. 对照组无结石形成；模型组 8 只动物高胆固醇膳食 4 wk 后有 7只形成结石，成石率达 87.5%，两组成石率差异有统计学意义（P0.05）.2.2 血脂变化与对照组相比，模型组动物血清 TG，CHO，HDLc 和 LDLc均有不同程度的升高，其中 CHO，HDLc 和 LDLc 的组间差异有统计学意义（表 1）. 将血脂逐项引入相关分析，仅发现 HDLc 与成石指数 LI 呈负相关（Pearson 相关系数 r=-0.501，P=0.015）. 将两组动物血清 CHO 的构成作了比较，发现对照组血清 CHO 以 HDLc 为主(69.2%)，而模型组 CHO 中 HDLc 仅31.6%.2.3 胆囊胆汁成分测定结果和 LI 模型组动物胆囊胆汁胆固醇含量升高，胆汁酸含量降低，分别与对照组相比，差异有显着性意义（P0.01,表 2）. 模型组 LI 较对照组升高（P0.05,表 2）.表 1 胆结石兔血血脂变化表 2 胆结石兔胆囊胆汁成分和 LI 2.4 肝组织 SCP2 mRNA 的检测模型组 SCP2 mRNA 表达较对照组升高（0.790.17 比 0.440.07，P0.05）有显着性意义(图 1).3 讨论高胆固醇膳食致兔胆囊结石时脂代谢变化的特点之一是胆固醇在血液中大量堆积. 我们发现模型组动物血清 TC，HDLc 和 LDLc 较对照组均升高，对照组 HDLc 占 TC 的 69.2%，LDLc 占 TC 的 6.6%；而模型组动物 HDLc 虽较对照组升高，但仅占 TC 的 31.6%，LDLc 却占 TC 的 42.2%. 由此可见模型组家兔血中胆固醇的堆积的同时，还存在构成比异常，主要表现为 LDLc 的升高，而 HDLc 的含量相对减少，使得 HDL 逆向转运胆固醇的作用大大减弱.我们发现 HDLc 与 LI 之间存在负相关，提示高水平的 HDLc 可阻止胆石的发生，这可能也与肝脏清除超负荷的胆固醇时优先利用 HDLc 合成胆汁酸提高了胆汁中胆汁酸的含量有关，但由于高胆固醇膳食时胆固醇直接和间接排泌入胆汁的数量远远超过胆汁酸，最终还是导致胆汁胆固醇过饱和，结石形成.体内胆固醇主要通过合成胆汁酸和直接分泌胆固醇入胆汁再排出体外，当胆固醇向胆汁酸合成的排除途径减弱后，则可能也只有通过排出更多的胆固醇入胆汁的形式排出体外，这必然造成胆汁中胆固醇过饱和、析出乃至结石形成. 在胆汁中胆固醇溶解于由胆汁酸、磷脂所构成的微团（micelle）中，LI 是指在一定的微团中实际溶解的胆固醇量与在同一体系中所能溶解的胆固醇最大量的比值，正常胆汁 LI 小于 1，胆固醇患者胆汁 LI 大于 1. 模型组 LI 较对照组升高，提示高胆固醇膳食诱发胆囊结石形成时可通过上调 SCP2 mRNA 表达、增加胆固醇向胆汁的排泌和减少胆汁酸的生成两条途径来提高胆汁 LI，促进胆囊结石的形成.【参考文献】1 Edqvist J, Blomqvist K. Fusion and fission, the evolution of sterol carrier protein2 J. J Mol Evol，2006, 62(3): 292-306.2 Milis DG, Moore MK, Atshaves BP, et al. Sterol carrier protein2 expression alters sphingolipid metabolism in transfected mouse Lcell fibroblastsJ. Mol Cell Biochem, 2006, 283(12): 57-66.3 Zanlungo S, Rigotti A, Nervi F. Hepatic cholesterol transport from plasma into bile: Implications for gallstone diseaseJ.Curr Opin Lipidol, 2004, 5(3): 279-286.4 Cui NQ, Zhang SK, Cui YF, et al. Overexpression of sterol carrier protein2 mRNA in patients with cholesterol gallstonesJ. Hepatobil Pancreat Dis Int, 2005, 4(1): 117-120.5 Carey MC. Critical tables for calculating the cholesterol saturation of native bileJ. J Lipid Res, 1978, 19(8): 945-955.