2012-2013 学年第 1 学期 生命科学 学院期末考试卷手性药物及其制备技术学号: 201074050129 姓名: 王 婷 班级: 2010 级制药工程（1）班 成绩：评语：（考试题目及要求）：见附页 半合成葡聚糖硫酸盐作为潜在的新型抗栓药物：综述苏珊阿尔班*和格哈德弗朗茨Institute of Pharmacy, University of Regensburg, Universita tsstrasse31， 93040 Regensburg, Germany2001 年 2 月 8 日由结构定义的半合成葡聚糖硫酸盐综合开发出的新型抗血栓药被作为潜在的肝素替代品。葡聚糖由于其不同的自然起源，被用作起始聚合物，由此产生的葡聚糖硫酸盐表现出明显的抗凝血作用；其中有的活性等同于肝素。通过研究其构效关系表明，除了分子量（MW）和硫酸化程度（DS） ，硫酸化方式和多糖的基本结构也是硫酸化多糖抗凝血作用的重要参数。它们的作用方式与肝素不同。其根据各自的结构，干扰不同阶段的凝血过程。在体内，它们表现出部分类似于肝素的抗血栓活性。然而，其在体内的抗血栓作用并不仅仅基于它们的抗凝血活性。葡聚糖硫酸盐纤溶酶的活性和其强大的 TFPI 释放效应也可能有助于这种作用。由于硫酸化多糖与凝血系统多方面的相互作用，使每个葡聚糖硫酸盐显示出依赖于其各自结构的作用方式。研究硫酸化葡聚糖发现，DS 1.0，分子量为 18 和 50 kDa，主要为 C2-和 C4-硫酸化的，线性 -1 ，3 - 葡聚糖硫酸盐最适合作为潜在的肝素替代品。这个研究结果证明了硫酸化多糖的各种结构参数对其抗血栓活性的影响。然而，硫酸多糖的生理作用不只限于凝血，对其他生物系统也具有多方面的调节作用。因此，使用复杂的糖类药物设计的方法，可能会获得具有特殊作用方式的新药。1.引言 60 多年来，糖胺聚糖肝素一直是预防和治疗血栓栓塞性疾病的首选药物。然而，其还存在着明显的有关临床应用上的问题，例如，它对抗凝血酶（AT ）缺陷患者的治疗是无效的，并可引起出血并发症，还可以导致肝素诱导的血小板减少的症状（1） 。此外，肝素还显示了由于其结构参数的变化而导致的生理活性的变化（2） 。从动物组织中分离的肝素，可能会导致严重的污染，例如，会引发疯牛病的朊病毒。另外，由于肝素使用在全球的不断普及，天然来源的肝素可能不足以满足今后人们的需要。因此，研究有效的替代品来代替肝素是现在一个重要的研究领域。而硫酸化多糖的化学性质可能与肝素相关。这些化合物引人注目的另一个原因是人们对其多种生物活性的不断了解。除了抗凝血和抗血栓作用（3） ，还发现了其抗动脉粥样硬化（4） ，抗增殖（5） ，防粘（6） ，抗血管生成（7,8） ，抗炎（9，10） ，抗补体（11）及抗病毒（12）等作用。目前，有一个特别有趣的问题即这些额外的活性是否或者在何种程度上支持肝素的治疗效益。利用肝素治疗的肿瘤患者的生存时间延长的多少被认为与肝素的抗增殖，抗血管生成和抗转移作用有关，此外，肝素的抗补体活性和潜在的抗炎活性可能主要在体外循环期间发挥作用（13） 。因此，硫酸多糖类似于甚至优于肝素的作用方式是一个很有前景的研究领域。这些化合物广泛存在于自然界。它们作为胞外基质的成分，主要存在于脊椎动物的细胞表面和某些海洋生物中。然而，大多数天然的硫酸多糖是多分散性大分子混合物的复合体，而且在它们的结构和生物活性方面有很大的差异。这使得任何天然聚合药物的开发利用变得复杂。结构定义的半合成硫酸多糖的构效关系可能更适合用于研究并建立其最佳结构来作为肝素替代品。2.起始聚合物的硫酸化半合成硫酸多糖的一个重要的前提是选择合适的多糖。他们应该是一应俱全，价格低廉并且化学定义明确。凝胶多糖和海带多糖（-1,3-葡聚糖） 黄原胶普鲁兰糖 木葡聚糖图 1 天然葡聚糖作为半合成硫酸化葡聚糖的起始多糖 例如，-1 ，3 - 葡聚糖凝胶（图 1） ，其满足所有这些要求。这种长链聚合物是最初从土壤中的非粪产碱菌中发现的一种胞外多糖（14） 。通过发酵方法，其被大量生产用于食品工业和其他工业。除了凝胶多糖，还可选择短链（5.6 kDa）的棕色藻类 -1 ，3 -海带多糖（图 1） 。这种储备多糖高达藻类干重的 50 。通过研究由黑酵母出芽短梗霉发酵产生的直链的，中性普鲁兰多糖（-1 ，4/1 ，6 葡聚糖） （图 1 ）来评估糖苷键类型对生物活性的影响。这种胞外多糖如凝胶多糖是一种重要的聚合物，其在食品，化妆品，医药等行业有多方面应用（15） 。为比较直链的硫酸多糖与其带支链的衍生物的作用，将凝胶多糖的 6 位分别用葡萄糖，龙胆二糖，鼠李糖，和阿拉伯糖取代（3,16） 。此外，有两种众所周知的天然的带支链的葡聚糖被作为起始聚合物：一种是长链的细菌多糖黄原胶（野油菜黄单胞菌） （图 1） ，其-1 ，4 - 葡聚糖主链上每两个葡萄糖单元被一个三糖单元所取代（由 -D -甘露糖-6 - 乙酸酯， -D-葡糖醛酸和 -D-甘露糖-4,6 - 丙酮酸缩酮组成） （17,18） ；另一个是 Glyloid 3S（大日本制药，大阪，日本） ，一种从罗望子种子（19）中分离出的高度支化的短链木葡聚糖（图 1） 。葡聚糖硫酸盐的分子量（ MW）是采用凝胶渗透色谱法（GPC ）通过测定其流体动力学体积来测定的。这不仅依赖于起始聚合物的链长，还依赖于硫酸化反应的条件。此外，它还随起始聚合物的温度（20）或超声波（21）的降解而发生变化。多分散性产品由 GPC 分馏后得到小分子量范围内的化合物。3.葡聚糖硫酸盐的合成起始葡聚糖的硫酸化通常是将三氧化硫- 吡啶配合物溶解在 DMF 中进行的。将这种配合物逐步加入多糖中溶解或微细悬浮于含有与吡啶等摩尔的硫酸化试剂的 DMF 中。这个程序在 LARM 等（22）所描述方法的基础上被修改和优化后，产生重现性好，高度硫酸化的非降解多糖衍生物（23） 。葡聚糖硫酸盐的硫酸化程度（ DS ，即，每个葡萄糖单体中所含的硫酸基团）被证明与其温度，反应时间和过量的硫酸化试剂有关（16,23,24） 。而关键的一步则是预处理，即，多糖的活化，如凝胶多糖-钠配合物的形成。另外，多糖的结构基础对其硫酸化程度也有很重要的影响。例如，与相应的长链凝胶多糖衍生物相比，经过相同的硫酸化程序产生的硫酸化海带多糖具有较高的 DS。由于普鲁兰糖中 -1，6-糖苷键上只含较少比例的游离伯羟基，而使 -1,3-葡聚糖比普鲁兰糖更容易进行硫酸化。 图 2. 凝血级联反应与凝血功能检查，记录这个过程中的不同阶段（为避免复杂性，正反馈循环，如FXI 活性，凝血酶辅助因子 V 和 VIII 的活性以及内在和外在的经典分化途径没被显示出来，详解请看文献 65） 。通过应用这种硫酸化方法，主要使葡萄糖六位上的伯羟基被取代。为了检测除了硫酸化程度，葡萄糖单元上硫酸基团的位置对其生物活性是否也有影响，而用不同的硫酸化方式生成 -1 ，3 - 葡聚糖硫酸盐。为了降低羟基在 2 位和 4 位的二次硫酸化，而使 6 位在硫酸化之前就被保护。比较各种保护基团（16）发现，adamantoyl 残余物（25）可使产物的 2 位和 4 位（19）的硫酸基达到 97 。4.葡聚糖硫酸盐的抗凝血活性 为了检测新型葡聚糖硫酸盐的抗凝血活性，对经典凝血试验（26）的凝血酶原时间（PT)，活化部分凝血酶时间（APTT） ，TT 进行了测定并做了抗 Xa 因子的凝血试验（ Heptest ） 。以普通肝素作为参考，并用第四国际标准肝素（第四 I.St ）测定其特定的抗凝血活性（单位/毫克） 。由各种凝固实验记录了凝血过程中不同阶段的相互作用（图 2） ，从而得知新型葡聚糖硫酸盐提供了抗凝血（27）作用的基本信息。PT 定了干扰外源性和内源性凝血途径的APTT。在 TT 则测定其最后一步凝血过程，即凝血酶介导的纤维蛋白的形成。Heptest ，尤其是在肝素的开发中，需测定其抑制因子 Xa。相比于无活性的非硫酸化的葡聚糖，硫酸化衍生物在所有这些测定中都表现出抗凝血作用。它们各自的活性范围由不到肝素活性（3,16,24）的 1 到肝素活性的 135 都取决于其各自的结构。在活化部分凝血酶时间（APTT） 和凝血酶时间（TT）内，葡聚糖硫酸盐表现出其最高的活性。肝素主要通过催化 Xa 因子和内源性凝血酶抑制剂 AT（28）而起抑制血液凝固的作用。在 Heptest 中，葡聚糖硫酸盐的活性只有肝素活性的 10。因此，关于 Xa因子，葡聚糖硫酸盐不存在类似于肝素的作用机制。由于缺乏本测定法的特异性，葡聚糖硫酸盐在 Heptest 中的活性仍很弱。Heptest 并不是只能用来测量抗 Xa 因子的活性，其还可用于测定抗凝血酶的活性，并在一定程度上影响其内源性凝血作用（29） 。同肝素一样（30） ，葡聚糖硫酸盐较弱的 PT 活性表明，外在部分的凝血作用并不是葡聚糖衍生物的重要作用。5.构效关系 对构效关系的广泛研究发现，半合成葡聚糖硫酸盐的抗凝血活性与它的一些结构参数有关。一个确定的最小电荷密度以及最小链长对任何抗凝血作用都是必不可少的。这些阈值和各多糖的基本结构都是互为条件的。短的直链 -1 ，3 -葡聚糖硫酸盐，即，硫酸化海带多糖，要求其 DS 大于 0.7 时才具有抗凝血活性（23） 。与此相反，高分子线性 -1 ，3 -葡聚糖硫酸盐只需 DS 为 0.5 就具有活性 。例如，DS 为 0.54，分子量 190 kDa 的硫酸化凝胶多糖在 APTT 和 TT 内，其活性达肝素的 28。DS 低于 0.7 时，带支链的，短链 -1 ,3-葡聚糖仍具有活性（16） 。相应地，DS 为 0.66，分子量 15 kDa 的阿拉伯糖支链上的 -1 ，3 - 葡聚糖硫酸盐，在 APTT 内的活性表现出肝素活性的 11 ，而在 TT 内的活性只有肝素的 6 。硫酸化普鲁兰糖只需更小的 DS 即有活性（31） 。在这里，DS 为 0.17，分子量 48 kDa的化合物在 APTT 内的活性达肝素活性的 5，而在 TT 内的活性达肝素的 8 。由此可得到一般规律，即所有试验中的凝血活性都随着葡聚糖硫酸盐 DS 的增大而提高（3,23,24,31） 。抗凝血活性的第二个决定性参数是该聚合物的链长（20） 。平均分子量越大，其抗凝血作用就越强。当分子量超过 150kDa 时，其活性不再增加。特别是凝血酶原的活性，对这个参数有强烈的依赖性：最小 MW 的凝血酶原在 TT 内的活性比其在 APTT 内的活性都高，但高分子化合物在 TT 内的活性也能超过其在 APTT 内的活性。DS 为 1.05 的硫酸化 -1 ,3-葡萄糖在 APTT 内的活性相当于肝素活性的 20 ，而这在 TT 检测时则完全无效。相反，含有相同 DS，分子量约 250kDa 的硫酸化凝胶多糖，在 TT 和 APTT 测定时的活性均为肝素活性的135%。由此得到结论，DS 为 1.0 的肝素，其 TT 活性与 APTT 活性的比值随葡聚糖硫酸盐分子量的增加而增大。葡聚糖硫酸盐各自 DS 和分子量之间的关系及其抗凝血活性是从被报道的其他硫酸化多糖包括硫酸化褐藻多糖（32,33） ，硫酸葡聚糖衍生物（34）和硫酸皮肤素（35）等中发现的。 除了 DS 和 MW，硫酸化方式对硫酸多糖的抗凝血活性也很重要。这已被证明“选择性地”用于 - 1 ，3 - 葡聚糖硫酸盐中（36） 。近期，硫酸化褐藻多糖和硫酸皮肤素也被报道出类似的结果