第二十四章 免疫诊断,提要,利用免疫学原理建立的免疫学检测 技术主要应用于对多种免疫性疾病（感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反应和肿瘤等）的诊断、疗效评估、发病机制探讨、以及对抗原性物质或免疫细胞的定性、定量，对细胞因子、粘附分子及细胞受体的检测等。,第一节 抗原或抗体的检测,抗原-抗体反应包括沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体结合反应和中和反应等。 抗原-抗体反应可 用已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。 免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原抗体反应的敏感性。,抗原-抗体反应的特点,抗原-抗体的结合是特异性结合,抗原抗体结合是分子表面的非 共价键结合,抗原抗体反应可分为两个阶段 特异性结合阶段 可见的反应阶段,抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现 象，于两者的分子比例密切相关,抗原抗体比例对反应现象的影响,抗原-抗体反应受多种因素影响,1 电解质：抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠作为 稀 释液 ，以供给适应浓度的电解质。 2 温度：一般常使用反应在37度水浴 或孵育箱中进 行。 3.酸碱度：抗原-抗体反应适应的酸碱度 为PH68。,抗原-抗体反应受多种因素影响,抗原抗体的检测方法,凝集反应 沉淀反应 补体溶血反应 和补体结合反应 中和反应 用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应,凝集反应 (Agglutination),细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集 现象，称为凝聚反应。 1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。 2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。,血 球 凝 集,沉淀反应 （Precipitation),血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，这一类反应称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀。大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。,单向免疫扩散 (Single Immunodiffusion),是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量成正比相关。本法常用于测定血清IgG、IgM、IgA 和 C 3等的含量。,含抗体的凝胶,沉淀环,双向免疫扩散 （Double Immunodiffusion),是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性 、组成和两种抗原相关性分析的检测。,免疫电泳 （Immunoelectrophoresis),是先将待侧血清标本作琼脂凝胶电泳，血清中各蛋白组分被分成不同的区带，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，把分成区带的蛋白抗原成分作双向免疫扩散，在各区带相应的位置形成沉淀弧。该法常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。,火箭电泳 （Rocket Electrophoresis),火箭电泳也称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特点是需时较短，故可用于快速沉淀标本中抗原的含量。,火箭电泳示意图,补体结合反应 （Complement Fixation, CFT),敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。,免疫标记技术,用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。,免疫荧光显微技术 (Immunofluorescence Technique),是用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素，FITC) 与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。 包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。,直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作标本染色。该法的优点是特异性强，但其缺点是每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。 间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。该法的优点是敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光亦会增加。 补体结合免疫荧光法：此法是在间接法的第一步抗原抗体反应时加入补体，使之与抗原抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗C3抗体进行示踪。,间接免疫荧光法示意图,免疫荧光显微技术,流式细胞术 （Flow Cytometry, FCM),FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，为当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。,流式细胞术,流式细胞仪工作原理,酶免疫测定 (Enzyme Immunoassay, EIA),是用酶（常用的有辣根过氧化物酶，HRP和碱性磷酸酶，AP) 标记的抗体进行的抗原抗体反应。EIA将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体， 后者测定组织中或细胞表面的抗原。,酶联免疫吸附试验 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA),是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、间接法BAS-ELISA等。,ELISA 检测抗体,放射免疫测定法 (Radioimmunoassay, RIA),是用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使检测的敏感性达pg水平。常用于标记的放射性核素有I125和I131。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。,放射免疫测定法(RIA)示意图,RIA法原理及标准曲线,75,50,30,10,0,1,10,100,1000,未标记抗原浓度（ng/ml),结合/未结合的放射活性（%）,免疫印迹法(Immunoblotting),是将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量。常用于检测多种病毒 如HIV 的抗体或抗原。,免 疫 印 迹 法 示 意 图,第二节 淋巴细胞 的测定,检测各群体淋巴细胞的数量与功能是观察机体免疫状态的重要手段。外周血是病人主要的检测标本，但仅代表再循环的淋巴细胞。实验动物还可取胸腺、脾、淋巴结等作为标本进行检查。,(1) 抗凝 静脉血,(2) 加等量NS,(4) 密度梯度离心,(3) 混匀后，缓慢加于分离液上,一、淋巴细胞类型和数目的测定,1、花结试验：E花结试验可用于检测T细胞数目。EA花结试验可用于检测B细胞数目。 2、免疫荧光法：常采用间接免疫荧光法。 3、流式细胞术：借助流式细胞仪（FCM)。,花结试验示意图,T细胞功能测定,体外法 ：T细胞增殖试验 形态学检查 3H-TdR掺入法 MTT法 体内法 ： 用生物抗原或化学抗原作皮内试验。 OT-PPD皮试 SD-SK皮试,淋巴细胞增殖试验（3H-TdR掺入法）示意图,细胞毒试验（51Cr释放法）示意图,酶联免疫斑点法 （Enzyme-Linked Immunospot, ELISA),是在ELISA的基础上建立的检测抗体生成细胞及细胞因子产生细胞的方法。,抗原包被的反应板,检测抗原特异性B细胞,T细胞产生CK的检测,淋巴细胞转化试验（形态学示意图）,原理：人T细胞表面有PHA或ConA受体，T细胞在体外受PHA或ConA的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞，以此测定T细胞的功能。,淋巴细胞增殖3H-TdR掺入法,原理：将单个核细胞中加入PHA共同培养，在终止培养前815小时加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR), 经-液体闪烁仪检测淋巴细胞DNA的3H-TdR掺入量，推测淋巴细胞增殖的程度。,MTT(四甲基偶氮唑盐）法,原理：在细胞培养终止前数小时加入MTT，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分解MTT产生蓝色甲攒（Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。,细胞毒试验,CTL介导的细胞毒试验：常采用51Cr释 放法 NK细胞的细胞毒试验：常用的靶细胞 为K562细胞,