第九章 发育毒性与致畸作用 （Developmental Toxicity and Teratogenesis）,第一节 概述 第二节 发育毒性与致畸性 第三节 致畸（发育毒性）作用机制 第四节 发育毒性和致畸作用试验与评价,第一节 概述,教材155156页,外源化学物,发育毒理学（developmental toxicology） 研究发育生物体在受精卵、妊娠期、出生后、直到性成熟的发育过程中，由于出生前接触导致异常发育的理化因素或环境条件后的发病机制和结果。,一、发育毒理学,是毒理学的重要分支学科，评定方法称为发育毒性试验。其中主要为致畸试验。,二、从畸胎学到发育毒理学,畸胎学,古代的神话人物如独眼巨人、海妖等原型可能来自严重畸形的婴儿。,Hybrid theory（杂交理论）认为畸形是人和动物杂交的结果，并且这种杂交动物广泛存在于神话传说中，如人头马身怪物，人身牛头等。,Teratology（畸形学）来自希腊语“ monster”（怪胎）； 1651年，William Harvey 提出发育障碍学说：畸形起因于器官或结构的不完全发育。,19世纪末期，对哺乳动物进行了实验畸胎学研究,现代实验畸胎学,1959年，日本水俣湾，汞废水污染引发先天水俣病,1960年前后，英、德、日本等国妇女 “反应停”（thalidomide）事件,先天畸形的危害,先天畸形是导致婴幼儿死亡的重要原因之一。我国婴幼儿死亡原因中，先天畸形占第二位，而在发达国家和我国的一些大城市已占首位。 在人类疾病谱中，先天缺陷导致寿命缩短分别是肿瘤和心血管疾病的8倍和5倍。 先天畸形给家庭和社会带来了沉重的精神压力和经济负担。,第二节 发育毒性与致畸性,教材156162页,一、基本概念和发育毒性的终点,1. 畸形（malformation） 指出生前因素引起发育生物体的严重的解剖学上形态结构的缺陷。 对发育、生长、形态、生理功能、生育力和（或）寿命可产生有害影响; 可以存活也可能不能存活。,致畸性（teratogenicity） 致畸作用（teratogenic effect） 指在妊娠期（出生前）接触外源性理化因素引起后代结构畸形的特性（作用）。,致畸物（teratogen） 在妊娠期接触能引起子代畸形的理化因素称为致畸物。,2变异（variation） 指同一种属的子代与亲代之间或子代的个体之间有时出现不完全相同的现象，是小的或次要的结构改变。,一般认为变异不影响正常生理功能，更不危及生命。 在动物致畸试验中，如果某种变异出现较多，并呈现一定剂量效应关系，应该引起注意。,孕体(conceptus) 从受精卵直到出生的整个发育生物体， 包括胚胎（或称胚体）、胎儿（或称胎体）和胎膜。,3胚胎胎儿毒性,胚胎毒性（embryotoxicity） 通常指外源性理化因素造成的孕体着床前后直到器官形成期结束的所有的毒性； 胎儿毒性（fetoxicity） 指器官形成期结束后的因素引发的任何毒性表现（包括死亡、体重降低、骨化迟缓、功能缺陷以及结构异常）。,在实验动物发育毒性试验中，通常不去区分胎儿与胚胎，所以使用胚胎-胎儿毒性更恰当。,4发育毒性（developmental toxicity） 是指出生前经父体和（或）母体接触外源性理化因素引起的在子代到达成体之前内出现的有害作用，包括：结构畸形、生长迟缓、功能障碍和死亡。,发育毒物（developmental toxicant） 能造成发育毒性的物质称为发育毒物。 发育毒物应是在未诱发母体毒性的剂量下产生发育毒性的物质。,5.出生缺陷（birth defect） 出生缺陷是指婴儿出生前即已形成的发育障碍，包括形态结构异常（畸形）和功能缺陷（如智力低下，代谢和行为的异常）。,行为畸胎学（behavioral teratology） 功能发育毒理学（functional developmental toxicity） 精神畸胎学（psychoteratology） 发育神经毒理学（developmental neruotoxicology） 功能畸胎学（function tertology）,二、发育各阶段发育毒性作用的特点,着床前期 从受精时算起，到完成着床之前。; 人类为第1112天，啮齿类动物为前6天; 很少发生特异的致畸效应 ; 也有着床前期接触毒物导致胎儿畸形的例子,如环氧乙烷，甲基亚硝脲等；,器官形成期* 在致畸作用中，对致畸物最敏感的阶段，又称为致畸敏感期或致畸作用危险期（critical period）； 人类是3 8周；大鼠约为9 17天；小鼠约为7.5 16天；家兔为11 20天； 外源化学物表现出发育毒性，以结构畸形最突出，也可有胚胎死亡、生长迟缓。,胎儿期 器官形成结束（以硬腭闭合为标志）后即进入胎儿期（人类从第56 58天起），直到分娩。 胎儿期以组织分化，生长和生理学的成熟为基本特色。 胎儿期外源化学物的不良作用主要表现为：全身生长迟缓、特异的功能障碍、经胎盘致癌和偶见死胎。,围生期和出生后的发育期 研究较多的是发育免疫毒性、神经行为发育异常和儿童期肿瘤。 围生期还是一生中对致癌物最敏感的时期；,三、母体毒性与发育毒性,（一）母体因素对发育毒性的影响,母体毒性（matermal toxicity） 是指化学毒物对孕母产生的损伤作用，表现为增重减慢、功能异常、临床症状，甚至死亡。目前常用增重减慢和死亡率来表示。,遗传学：决定因素 疾病 营养 应激 对胎盘的毒性,（二）母体毒性与胚胎毒性的关系,1具有胚胎毒性，但无母体毒性。 2出现胚胎毒性也出现母体毒性。 3. 具有母体毒性，但不具有致畸作用。 4在一定剂量下即无母体毒性，也不表现胚胎毒性。,四、发育毒性的剂量反应模式和域值的概念,（一）发育毒性的剂量反应模式,（二）发育毒性的域值的概念,主要有以下三种类型： 1在远低于胚胎致死剂量下即可出现致畸，甚至全窝致畸。（高度致畸，较少见）,2除了在较高剂量几乎全窝胚胎死亡外，正常胎、生长迟缓和结构畸形同时存在。（较常见）,3有生长迟缓和胚胎致死但没有畸形发生。,第三节 致畸（发育毒性）作用机制,教材162164页,干扰基因表达 基因突变与染色体畸变 损伤细胞和分子水平的翻译 细胞凋亡,干扰细胞细胞交互作用 通过胎盘毒性引起发育毒性 干扰母体稳态 内分泌干扰作用,第四节 发育毒性和致畸作用试验与评价*,教材164169页,动物发育毒性试验 流行病学研究和人类的证据 发育毒性的替代实验,一、动物发育毒性试验*,1966年，美国FDA提出人体使用药物生殖毒性安全性评价的三阶段试验。 1993年和1995年，进行了新的改进，已经成为国际接受的实验程序，检测人用医药产品生殖毒性的ICH三阶段试验指南。,ICH三阶段试验指南提供了动物种（系）选择、给药途径、剂量水平、给药次数和间隔、暴露期间、实验的样本大小、观察技术、统计分析和报告要求的指南。,阶段试验：雌雄性交配前受孕雌性受精雌性着床期间染毒，研究对成年雌雄性的生殖功能、配子的发生及成熟、交配行为、受精、着床前的发育和着床的影响。 目的评价化学毒物对雌、雄生殖细胞、胚胎和胎儿的影响。 （交配前染毒）,一般生殖毒性试验,动物选择：常用大鼠，最好另用家兔，避孕药还需要用猴子试验。雌、雄每组各20只。 分组：一般分3个剂量组、1个对照组。 染毒：在交配前，雌雄分别给药14天和60天，雌鼠受孕后继续给药至器官形成期末。,处置：孕期20天处死孕鼠，剖腹检查子宫和胎鼠。 观察指标：黄体数、着床数、吸收胎、死胎数、畸胎数、活胎数。 计算：雌鼠受精率、妊娠率、着床前死亡率。,阶段试验：从着床到硬腭闭合期间染毒，研究对成年雌性生殖功能、胚胎发育、器官形成期的发育毒性。 目的是评价受试物的胚胎-胎儿毒性和致畸性。 （器官发生期染毒）,传统致畸试验,动物选择：致畸试验中动物应选择，食性和对受试物代谢过程与人类接近，体型小、驯服、容易饲养和易繁殖及价廉外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造与人类接近的动物。,致畸试验可选用二种哺乳动物，一般首先考虑大鼠，此外为小鼠或家兔。,剂量分组 在确定剂量时，一方面要求找出最大无作用剂量以及致畸阈剂量；同时还要保持母体生育能力，不致大批流产和过多胚胎死亡和避免母体死亡。一般应先进行预试。根据预试结果可以确定正式试验剂量。,应最少设3个剂量组，另设对照组。一般最高剂量不超过LD50的1/51/3，低剂量可为1100130 。,动物交配处理 将性成熟雌雄动物按雌雄1:1或2:1的比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。（每组至少需要有20只怀孕雌鼠存活） 染毒 在受孕大鼠器官形成期给予受试物。,胎仔检查 自然分娩前12日将受孕动物处死剖腹，取出子宫及活产胎仔，记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第1920天，小鼠第1819天。,观察指标 临床症状、孕鼠体重与增重、饲料摄食量、黄体数、着床前、活胎数、性别比例、活胎重量、死胎数、外观畸形、骨骼畸形和内脏畸形。,胎鼠取出的过程,胎鼠内脏检查,胎鼠骨骼检查,阶段试验：从着床到幼仔断乳期间对孕母（以及乳母）染毒，研究包括从着床到子代性成熟的母体生殖毒性（成年雌性生殖功能：妊娠、分娩和哺乳）和子代的发育毒性（胚胎、胎儿生长发育，新生幼仔宫外生活的适应性，断乳前后的生长发育，独立生活能力和性功能成熟）。,围生期毒性试验,动物选择 一般选择大鼠。 染毒 孕期15天开始给药至生产后28天止。 处置 孕鼠在断乳期末处死（产后28天），检查新生胎鼠。,观察指标 着中检查新生仔鼠的存活与发育，也包括孕期流产、产程、分娩、哺乳的情况。 具体指标：出生存活率、4天存活率、21天存活率、出牙、开眼、睾丸下降、阴道开口；行为反射指标。,三种生殖发育毒性试验给药时间比较 （斜线部分表示为给药期）,二、流行病学研究和人类的证据 1人类证据的获得 可以用流行病学方法来研究环境发育毒物对人类发育的影响，包括其性质、程度以及原因。 2发育毒性资料的使用,三、发育毒性的替代实验 1大鼠全胚胎培养 （whole embryo culture,WEC）,embryo on Day 3 of culture,embryo on Day 5 of culture,2胚胎细胞微团培养（micromass culture) 3小鼠胚胎干细胞实验 (mouse embryonic stem cell test，EST) 4发育毒性的体内预筛实验（C.K试验）,欧共体（EEC）和经济合作与发展组织（OECD）建议的致畸物分级标准。主要根据动物试验和人群调查资料，具体分级标准：,1级，已确定人类母体接触后可引起子代先天性缺陷； 2A级，对动物肯定致畸，但对人类致畸作用尚未确定因果关系； 2B级，动物试验结果肯定致畸，但无人类致畸资料； 3级，尚无结论性肯定致畸证据或资料不足； 4级，动物试验阴性，人群中调查结果未发现致畸。,