2019/2/24,1,第十三章 程序性细胞死亡 与细胞衰老,程序性细胞死亡 （programmmed cell death,PCD） 细胞衰老 （cell ageing或cell senescence ）,2019/2/24,2,程序性细胞死亡,动物细胞程序性死亡 细胞凋亡（apoptosis） 细胞坏死（necrosis） 细胞自噬（autophagy） 植物细胞与酵母细胞的程序性死亡 植物细胞的程序性死亡：木质部管状细胞的成熟过程，植物细胞在受到真菌或细菌感染后会发生主动快速死亡。死亡细胞的残余被细胞壁固定在原位，被液泡中水解酶消化。 酵母细胞的程序性死亡：与动物程序性死亡类似。,2019/2/24,3,细胞凋亡(Apoptosis),细胞凋亡的概念和特征 细胞凋亡的生理意义：对于动物个体的正常发育，自稳态的维持，免疫耐受的形成，肿瘤监控等多种生理及病理过程具有重要意义。 蝌蚪尾的消失，发育过程中手和足的成形过程； 脊椎动物的神经系统的发育； 凋亡不足导致肿瘤在内的多种疾病，调亡过度导致机体免疫功能的丧失。 细胞凋亡的检测方法 细胞凋亡的分子机制,2019/2/24,4,细胞凋亡的概念和特征,细胞凋亡生物学意义：强调这种细胞的死亡方式是自然的生理学过程，是受基因调控的主动的生理性细胞自杀行为。 动物细胞凋亡的过程，在形态学上分为三个阶段： 凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布； 凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体； 凋亡小体逐渐为邻近的细胞或体内的吞噬细胞所吞噬，凋亡细胞的残余物质被消化后重新利用。,2019/2/24,5,细胞凋亡的检测方法,形态学观测：染色法（台盼蓝）、透射和扫描电镜观察。 DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带。 TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法。 彗星电泳法（comet assay）：将细胞裂解处理，电泳并用荧光染料染色，凋亡细胞DNA降解片断在电场中泳动速度快，使细胞核呈彗星式图案。 流式细胞分析：凋亡细胞DNA断裂和丢失，呈亚二倍体状态，用碘化丙腚染色使DNA产生激发荧光。,2019/2/24,6,细胞凋亡的分子机制,诱导细胞凋亡的因子 Caspase家族与凋亡 Caspase Caspase依赖性的细胞凋亡 死亡受体起始的外源途径 线粒体起始的内源途径 Caspase非依赖性的细胞凋亡 生死抉择：细胞凋亡的调控,2019/2/24,7,诱导细胞凋亡的因子,物理性因子，包括射线（紫外线， 射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等。 化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，钙离子载体，维生素K3，视黄酸，细胞毒素，DNA和蛋白质合成的抑制剂，正常生理因子（激素，细胞生长因子等）失调以及肿瘤坏死因子（TNF）处理等。,2019/2/24,8,Caspase,Caspase：是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶，活性位点均包含半胱氨酸残基，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶（Cysteine aspartic acic specific protease），即Caspase。负责选择性切割蛋白质，使靶蛋白活化或失活。 线虫(C. elegans)凋亡研究发现ced3，ced4基因促进细胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。Ced3哺乳类同源物是白介素-1转换酶（Interleukin-1 converting enzyme，ICE），被命名Caspase-1： 哺乳动物细胞Caspase家族成员有15种。 细胞凋亡的分为激活期和执行期两个阶段。,2019/2/24,9,细胞凋亡分为两个阶段,激活期：前期细胞应答死亡信号，起始Caspase活化。凋亡信号刺激酶原分子在特异性的Asp位点被切割形成两个大小亚基的异二聚体具有活性的Caspase； 执行期：后期执行Caspase活化，执行细胞死亡程序。起始Caspase招募执行Caspase酶原分子后进行切割产生具有活性的执行Caspase切割细胞内重要的结构和功能蛋白细胞凋亡。已知执行Caspase底物约280种。 起始Caspase和执行Caspase组成细胞内凋亡信号的联级分子网络，凋亡程序一旦启动，网络顶端起始Caspase首先活化，切割下游Caspase酶原，使得凋亡信号在短时间内迅速放大并传递到整个细胞，产生凋亡效应。,2019/2/24,10,死亡受体起始的外源途径,凋亡信号通路：死亡配体主要是肿瘤坏死因子（TNF)家族成员，死亡配体的生物学功能是通过与细胞表面的受体结合来实现的，TNF-R1和Fas是死亡受体家族的代表成员，它们的胞质部分均含有死亡结构域（DD），负责招募凋亡信号通路中的信号分子。 举例：配体与Fas结合Fas聚合Fas通过胞质区的死亡结构域招募接头蛋白FADD和Caspases-8酶原形成死亡诱导复合物DISCCaspases-8酶原在复合物中通过自身切割被激活切割执行者Caspases-3酶原产生有活性的Caspases-3导致细胞凋亡。活化的Caspases-8酶还通过切割Bcl-2家族成员的Bid将凋亡信号传递到线粒体，引发内源途径，信号进一步放大。,2019/2/24,11,线粒体起始的内源途径,细胞受到内部或外部的凋亡信号刺激时，线粒体外膜的通透性会发生改变，向细胞质基质中释放出凋亡相关因子，引发细胞凋亡。哺乳动物细胞接受凋亡信号刺激，CytC从线粒体释放到细胞质中，与另一个凋亡因子Apaf-1结合，诱导细胞凋亡发生。 线粒体外膜通透性改变主要受到Bcl-2蛋白家族的调控，是Ced-9在哺乳类中的同源物，含有一个或多个BH结构域，定位在线粒体外膜上，或接受信号后转移到线粒体外膜上。 细胞接受凋亡信号后促凋亡因子Bax和Bak发生寡聚化，从胞质中转移到线粒体外膜上，与膜上阴离子通道蛋白作用，使通道开放，线粒体内凋亡因子（CytC）释放到细胞质基质中，引发细胞凋亡。 Bcl-2、线粒体与细胞凋亡,2019/2/24,12,Caspase非依赖性的细胞凋亡,凋亡诱导因子（AIF）：是能够诱导Caspase非依赖性细胞凋亡的因子，位于线粒体外膜，凋亡过程中，AIF从线粒体转移到细胞基质内，进而进入细胞核，引起核内DNA凝集并断裂成50kp大小的片段。 限制性内切酶G（Endo G）：属于Mg2+依赖性的核酸酶家族，定位于线粒体，主要功能负责线粒体DNA的修复和复制。受到凋亡信号的刺激后， Endo G从线粒体释放出来进入细胞核，对DNA进行切割。在Caspase未被激活的情况下，产生典型的以核小体为单位的DNA片段。,2019/2/24,13,生死抉择：细胞凋亡的调控,Caspase抑制因子：直接与Caspase活性分子结合，阻抑其对底物的切割作用，包括c-IAP家族7个成员，c-FLIP，BAR和ARC；所有IAP家族成员都具有70个氨基酸残基组成的BIR结构域，对抑制凋亡是必需的。 IAP家族成员的抗凋亡作用也能被特异的抑制因子解除，当凋亡程序启动后，有两种蛋白Smac/DIABLO和Omi/HtrA2与CytC一起从线粒体中释放，两种蛋白含有IAP结合基序，与IAP结合并释放出被IAP封闭的Caspase。,内源性Caspase抑制因子,2019/2/24,14,2019/2/24,15,细胞坏死（necrosis）, 细胞坏死是细胞区别于细胞凋亡的另一种典型的细胞死亡方式，当细胞受到意外损伤或严重的病理性刺激的情况下细胞发生坏死；细胞内ATP下降到无法维持细胞存活的水平，坏死细胞的细胞质出现空泡，细胞质膜破损，细胞内含物释放到胞外，引起炎症。细胞坏死过程染色体不发生凝集，不产生有规律的200bp的DNA片段。 细胞坏死可能是细胞“程序性死亡”的另一种形式，推测的原因是DNA损伤的积累导致DNA修复蛋白：多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶PARP被活化，使得细胞核内NAP+大量减少，导致糖酵解被抑制，ATP水平下降。,2019/2/24,16,细胞自噬（autophagy）,正常的动物细胞为了维持细胞内环境的动态平衡，需要不断地降解功能失常的或不需要的细胞结构，如各种蛋白质、细胞器以及各种细胞组分： 寿命短的蛋白质通过泛素-蛋白酶体系降解； 寿命较长的细胞结构及蛋白质通过细胞自噬途径。 细胞自噬参与了细胞死亡的过程，是与细胞凋亡不同的另一种程序性死亡方式。线虫幼虫在营养不良时会通过细胞自噬降解自身的部分细胞维持个体存活。细胞自噬不需要吞噬细胞就能自我销毁，可能是细胞凋亡的补充途径。,2019/2/24,17,细胞衰老 (cellular aging或cell senescence),细胞衰老的概念及特征 细胞衰老的分子机制 细胞衰老与个体衰老和癌症的关系,2019/2/24,18,细胞衰老的概念及特征,概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是 Hayflick界限 细胞衰老过程形态结构方面的变化 细胞核的变化：体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大，细胞核的核膜内折（invagination）、染色质固缩化。 内质网的变化：衰老动物内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的总量减少了。 线粒体的变化：细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大。 致密体的生成：衰老的动物细胞致密体积累，由溶酶体或线粒体转化而来。 膜系统的变化：衰老的细胞，其膜的流动性降低、韧性减小，衰老细胞间隙连接减少。,2019/2/24,19,不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数,2019/2/24,20,细胞衰老的分子机制,复制衰老的机制：端粒酶的发现证实端粒长度与衰老有着密切的关系，端粒被认为是细胞的“分子时钟”。pRb蛋白与转录因子E2F家族结合阻抑其活性，E2F负责转录G1/S期转换以及DNA复制过程中的基因，E2F被pRb封闭；CDK磷酸化pRb细胞可进入S期；如果CDK活化被抑制，细胞停留在G1期，阻断细胞周期正常运行，引发复制型细胞衰老。CDK抑制因子（p16和p21）引起衰老。 胁迫诱导的早熟性衰老：代谢过程中产生的活性氧基团或分子（ROS- O2-，OH-，H2O2），引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。 单细胞与衰老: 酵母染色体外环型rDNA（ERC）的积累， ERC集中在母细胞，不进入子细胞，导致母细胞ERC积累而衰老。,2019/2/24,21,2019/2/24,22,2019/2/24,23,2019/2/24,24,细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图 1细胞色素c诱导0 h 2细胞色素c诱导1 h 3细胞色素c诱导2 h 4细胞色素c诱导3 h 5细胞色素c诱导4 h 6阴性对照 7Marker （ 自赵允、翟中和）,2019/2/24,25,2019/2/24,26,a 正常T细胞杂交瘤细胞 b 凋亡细胞(扫描电镜) c 凋亡细胞(透射电镜),2019/2/24,27,caspase 超家族成员及其在细胞凋亡过程中的功能,2019/2/24,28,BCL-2家族成员,2019/2/24,29,2019/2/24,30,2019/2/24,31,2019/2/24,32,2019/2/24,33,坏死细胞,凋