细胞凋亡与肿瘤,Apoptosis and Tumor,第 八 章,长海医院病理科 何妙侠,学 习 要 求,1 掌握细胞凋亡的概念及与坏死的区别 2 掌握细胞凋亡的基因调控机制及其与肿瘤 发生的关系 3 了解细胞凋亡的常用检测方法及其特点,前 言,对细胞死亡的认 识,Nature Reviews, Molecular cell biology. 2001; 2: 545,P C D Apoptosis,1858年，Virchow开始研究细胞死亡 1951年, Glucksman提出程序化细胞死亡 (Programmed Cell Death, PCD) 1972年, Kerr提出细胞凋亡 （Cell Apoptosis）,Sydney Brenner H. Robert Horvitz John E. Sulston,2002年英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯特霍维茨和英国人约翰苏尔斯顿， 因在细胞凋亡研究工作中取得的杰出成就 获诺贝尔生理与医学奖,主 讲 内 容,细胞凋亡特点,细胞凋亡检测,发生调控机制,细胞凋亡与肿瘤,细胞凋亡特点,细胞凋亡特点,概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别,细胞凋亡特点,概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别,细胞凋亡是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡的过程,(dropping off , falling off),细胞凋亡特点,概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别,细胞凋亡是高度有序的基因控制的一系列活性酶参与的过程，是多细胞动物生命现象的重要属性,细胞凋亡特点,概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别,细胞凋亡与胚胎发生发展、个体形成、器官的细胞平衡稳定等有密切的关系,蝌蚪尾 消失,发育过程 手足成形过程,脊椎动物 神经系统发育,细胞凋亡特点,概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别,近年来研究表明，肿瘤的发生与细胞凋亡的异常密切相关；细胞凋亡受抑作为细胞增殖紊乱的对应面在肿瘤发生发展和转归方面均有重要作用。,细胞凋亡特点,概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别,该“死”的细胞不死，如自身免疫性疾病，恶性肿瘤等 不该死的细胞死了，可能与老年性痴呆、帕金森症等有关,细胞凋亡特点,概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别,细胞凋亡与衰老密切相关 细胞凋亡对维持机体的遗传稳定性起着重要的作用,老 化,细胞凋亡特点,概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别,程序性死亡是功能上的概念，而细胞凋亡是形态学上的概念，不是所有的程序性死亡都表现为凋亡，即不一定存在凋亡的形态学改变,细胞凋亡特点,概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别,凋亡细胞形成多个大小不等有膜包裹的 凋亡小体（apoptotic bodies）内含形态保存完好的细胞器和/或浓缩的细胞核碎片，后期被吞噬细胞清除,细胞凋亡特点,概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别,1 受基因调控，死亡过程具有程序性，需要某些基因的启动并合成新的RNA和蛋白质,细胞凋亡特点,概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别,2 形态学上表现为细胞皱缩、染色质沿核膜聚集、胞体胞核裂解包裹形成凋亡小体,细胞凋亡特点,概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别,3 常单个存在于组织中 4 周围组织无炎症反应,细胞凋亡特点,概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别,5 DNA片段化：琼脂凝胶电泳可见特殊的阶梯状由不同倍数的l80200bp核苷酸组成DNA梯带图 6 合成一些大分子物质,细胞凋亡特点,概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别,细胞凋亡与细胞坏死的区别,细胞凋亡检测,细胞凋亡检测,形态学观察 细胞膜完整性 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测,细胞凋亡检测,形态学观察 细胞膜完整性 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测,1 光学显微镜观察 优点：光镜技术简单、快速，能短时间内 进行大样本分析 缺点：样本制备复杂、耗时 形态计数常受到主观因素干扰 重复性差,细胞形态学的检测,2 电子显微镜观察 优点：可显示凋亡细胞的许多形态学特点 尤其是膜结构和细胞器的变化 主要用于获取细胞凋亡的定性资料 缺点：样本制备复杂、耗时,细胞形态学的检测,细胞凋亡检测,形态学观察 细胞膜完整性 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测,1 台盼兰（Trypan blue）染色法 台盼兰为细胞膜非通透性活性染料，坏死细胞着色，而活细胞与早期凋亡细胞不着色 意义： 方法简单、便捷； 常常用于细胞死亡的初步评估,细胞膜完整性的检测,2 丫啶橙（acridine orange, AO）和溴化乙啶 （ethidium bromide, EB）双染法 AO和EB都能结合DNA的荧光染料，可 分别产生兰色和橙色荧光，其中 AO能透过 完整的细胞膜，而 EB 则只能染色胞膜受损 的细胞,细胞膜完整性的检测,AO/EB双染法意义 可用于荧光显微镜或流式细胞仪区分活细胞或早期凋亡细胞和坏死细胞或继发性坏死细胞 较台盼兰染色精确、详细,细胞膜完整性的检测,细胞凋亡检测,形态学观察 细胞膜完整性 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测,琼脂糖电泳法 琼脂糖凝胶电泳中 细胞凋亡呈现具有特征性的“阶梯” （DNA ladder）样条带外观 坏死细胞则因DNA的随机降解却常出 现弥散样外观,DNA断裂的检测,J Clin Pathol: Mol Pathol 2000;53:5563,J Clin Pathol: Mol Pathol 2000;53:5563,琼脂糖电泳法 缺点： 目前已被更为敏感的同位素标记、 原位末端标记技术所替代,DNA断裂的检测,细胞凋亡检测,形态学观察 细胞膜完整性 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测,流式细胞仪检测（flow cytometry, FCM） 几乎所有凋亡细胞的特征性代谢、生化和分子特点都可利用FCM的单参数和/或多参数分析进行检测 优点：单个细胞分散相中辨别凋亡细胞； 快速、准确；应用范围广,快速准确的定量分析,细胞凋亡检测,细胞膜完整性 形态变化 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测,Annexin V检测技术 原理：磷脂酰丝氨酸（PS）外翻是早期凋 亡细胞的重要形态特征之一，而依 赖Ca2+的磷脂结合蛋白Annexin V则 具有与PS高亲和结合特性，将其作 为检测细胞膜表面PS的敏感探针试 剂，用于凋亡细胞检测,敏感的定位检测,Annexin V检测技术 优点：1 对凋亡细胞进行定性及定位检测 2 同时使用膜非通透性DNA染料如 PI等，就能从Annexin V染色细 胞中将凋亡和坏死细胞区别开 来：凋亡细胞(-)，坏死细胞(+),敏感的定位检测,Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV+PI,DNA检测技术 原理：根据DNA聚合酶能够填补双链DNA中 单链的碱基缺失部分的基本原理， 应用同位素或非同位素（如生物 素，FITC等）标记的三磷酸核苷酸 （dNTP）形成新的DNA，以了解DNA 是否断裂和发生DNA断裂的细胞数量,原位末端标记检测,优点：常用荧光素FITC标记物，故可以 通过FCM或荧光显微镜检测相应细 胞的携带荧光强度，进行快速定 性、定位、定量及大批量细胞悬液 或涂片的回顾性研究，是当前较流 行的一类细胞凋亡评判方法,原位末端标记检测,标记方法 （1）DNA 聚合酶I或Klenow 大片段介导的原位缺口平移(in situ nick translation，INST) （2）末端DNA转移酶dUTP缺口末端标记法 (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick endlabeling, TUNEL),原位末端标记检测,TUNEL法的优点 1 定性和定位：对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反映凋亡细胞最典型的生物化学和形态特征 2 可用于多种来源标本：如细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等 3 操作简单，灵敏度高：直接标记步骤少，操作简便，且间接标记有信号放大的作用,原位末端标记检测,1 端粒酶检测：90%的凋亡都具有端粒酶活性 2 mRNA水平检测：通过检测fas, Bax-和 bcl-X基因的 mRNA表达水平可反映细胞凋亡的水平 3 细胞内氧化还原状态：谷胱甘肽状态检测 4 细胞色素C定位检测：细胞色素C存在于线粒体内外膜之间，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞质，结合Apaf-1 启动级联反应 5 线粒体膜电位变化：线粒体膜电位耗散启动凋亡,其它凋亡检测方法,细胞凋亡检测方法小结,定性和定量 定 性：琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电子显微镜和荧光显微镜） 定量或半定量：流式细胞仪法、原位末端标记法、ELISA定量、琼脂糖凝胶电泳,区分凋亡与坏死 可区分：琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（透射电子显微镜最可靠）、PI双染色法流式细胞仪检测 无法区分：原位末端标记法、PI单染法流式细胞检测,细胞凋亡检测方法小结,标本来源不同 组织：主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳) 培养细胞：几乎所有方法,凋亡时期不同 早期：细胞外膜磷脂酰丝氨酸的检测、细胞内氧化还原状态改变检测、细胞色素C定位检测、线粒体膜电位变化的检测 晚期：原位末端标记法、琼脂糖凝胶电泳、端粒酶检测,发生调控机制,凋亡发生调控机制,凋亡发生过程 凋亡相关因素 凋亡调控机制 凋亡信号通路 凋亡调控基因,凋亡发生调控机制,凋亡发生过程 凋亡相关因素 凋亡调控机制 凋亡信号通路 凋亡调控基因,诱导启动,信号传递,凋亡实施,吞噬搬运,各种凋亡诱导分子(细胞内/外),线粒体途径 (P53 bcl-2家族),死亡受体途径 (Fas-Fas配体),Caspase 8,Caspase 9,Caspase 3,细胞凋亡,1 接受凋亡信号 2 凋亡调控分子间的相互作用 3 蛋白水解酶（Caspases）的活化 4 凋亡的级联反应,凋亡发生过程,诱导期：诱导期是由特定的凋亡诱导信号所 决定的 效应期：活化的“中央处理器”（central executioner）启动和“宣判”细胞迅 速进入降解期 降解期：出现特征性形态学和生物化学改变,凋亡过程分期,凋亡全过程需时约数分钟至数小时不等 从凋亡信号转导到凋亡执行的各个阶段都有负调控因子存在，以形成完整的反馈环路，使凋亡过程受到精确严密的调控,凋亡发生调控机制,凋亡发生过程 凋亡相关因素 凋亡调控机制 凋亡信号通路 凋亡调控基因,（一）诱导性因素 细胞凋亡是一个程序化的过程，正常情况下它并不“随意”启动，只有当细胞受到来自细胞内外的凋亡诱导因素作用时才会启动 凋亡诱导因素是凋亡程序的启动者。在少数情况下细胞凋亡可自发产生，但多数是在诱导因素的作用下发生,凋亡相关因素,1.激素和生长因子失衡 生理水平的激素和生长因子是细胞正常生长不可缺少的因素，一旦缺乏，细胞会发生凋亡；相反，某些激素或生长因子过多也可导致细胞凋亡，例如：强烈应激引起大量糖皮质激素分泌，后者诱导淋巴细胞凋亡，致使淋巴细胞数量减少,凋亡相关因素,2.理化因素 射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药物等，均可导致细胞凋亡。例如：电离辐射可产生大量氧自由基，使细胞处于氧化应激状态，DNA受损，引起细胞凋亡,凋亡相关因素,3. 免疫性因素 免疫细胞在生长、分化及执行防御、自稳、监视功能中，可释放某些分子导致免疫细胞本身或靶细胞的凋亡。例如：细胞毒T淋巴细胞（CTL）可分泌颗粒酶（granzyme），引起靶细胞发生凋亡,凋亡相关因素,4.微生物学因素 细菌、病毒等致病微生物及其毒素可诱导细胞凋亡。例如：HIV感染时，可致大量CD4+ T淋巴细胞凋亡,凋亡相关因素,5. 其 他 如缺血与缺氧，神经递质（如谷氨酸、多巴胺），失去基质附